不同温度对脊尾白虾胚胎发育与幼体变态存活的影响

梁俊平，李 健 ，李吉涛，刘萍，赵法箴，刘德月，戴芳钰

(1.中国海洋大学，青岛 266003;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛 266071)

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)又名白虾、小白虾和迎春虾等，隶属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、白虾属(Exopalaemon)，主要分布于我国整个大陆沿岸和朝鲜半岛西岸的浅海低盐水域，以渤海和黄海产量最高，是我国特有的3种经济虾类之一，其产量仅次于中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)和中国毛虾(Acetes chinensis)［1-2］。由于其具有繁殖能力强、生长速度快、生长季节长和环境适应性广等优点，近年来，随着沿海滩涂的开发，养殖面积也迅速扩大，据不完全统计，目前全国脊尾白虾养殖面积达1万余公顷，已成为池塘单养和其它种类混养的重要经济虾类［3-6］，年平均效益可达1—2万元/hm2［7-9］。脊尾白虾具有良好的养殖前景，但目前的池塘养殖主要依靠捕捞海区天然虾苗或投放抱卵亲虾自行繁殖苗种［8，10-11］，严重制约了规模化人工养殖的发展。因此，在我国沿海地区进行规模化生态养殖脊尾白虾，首先必须突破脊尾白虾全人工苗种培育技术难关。

在虾蟹类育苗中，温度是关键因子之一，特别是对胚胎及幼体发育有重要的作用［12］。在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、中国对虾(F.chinensis)、长毛对虾(Fenneropenaeus Penicillatus)、红螯光壳螯虾(Cherax quadricarinatus)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)和锯缘青蟹(Scylla serrata)［13-19］等多种养殖虾蟹类中，均详细研究了温度对受精卵孵化及幼体变态发育的影响。而目前关于脊尾白虾胚胎及幼体变态受温度影响的研究较少，仅见20世纪80年代末王绪峨［20］对受精卵孵化做了初步的研究，为脊尾白虾胚胎形态及早期发育奠定了一定的基础。本文将探究脊尾白虾胚胎发育生物学零度和有效积温，以及幼体变态发育的最适温度，以期丰富对脊尾白虾早期个体发育的认识，为脊尾白虾人工繁育技术的建立提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用脊尾白虾捕自莱州湾，体长41.98—64.81 mm，体重 1.24—4.04 g，暂养于 200 L(80 cm×50 cm×50 cm)PVC水族箱内，水温(12.4±0.3)℃，充气。投喂冷冻大卤虫，8:00和18:00各1次。每天定时吸污换水。

沙滤自然海水，盐度31.2，pH 值8.2，NH3-Nm和 NO－2-N浓度分别低于0.05 mg/L和0.02 mg/L。

1.2 实验方法

1.2.1 受精卵孵化温度分组

挑选多对性成熟的雌、雄脊尾白虾放入60 L(50 cm×40 cm×30 cm)PVC水族箱，每个水族箱内各放1对，每天8:00和18:00各投饵1次，定时换同温度海水1/5。准确记录雌雄虾交尾时间，交尾后将雄虾移出，温度设置及其变化范围如表1所示，其中12℃组为自然水温，其它温度组采用加热棒加温，以0.5℃/h升温，直至设置所需温度。每天记录各实验组的温度，直至Ⅰ期溞状幼体(Z1)孵出。

表1 脊尾白虾受精卵孵化温度设置Table 1 The different water temperature levels of egg incubation of Exopalaemon carinicauda

1.2.2 幼体发育分组

设置18、20、22、24、26和28℃ 6个温度梯度，每个温度组设3个重复。将刚刚孵化出活力好的溞状幼体随机分布在1.5 L烧杯内，水体为1 L，密度为20个/L，采用水浴加热，以1℃/h升温到设定温度，微充气。所有幼体均由同一亲虾所孵化。

溞状幼体投喂卤虫无节幼体，每天3次，分别为9:00、14:00和19:00。每天上午投喂前换同温度海水1/5，并记录各发育阶段的幼体数量。

1.2.3 幼体发育指数和存活率的计算

幼体发育指数(Larval stage index，LSI) 根据文献［21］计算脊尾白虾幼体发育指数，以表示幼体变态发育的快慢，幼体发育指数越大，则表示幼体变态越快。计算公式如下:

式中，Z1、Z2、…、Z6分别表示脊尾白虾溞状幼体各期存活的数量，P表示变态为仔虾的数量;且从溞状幼体到仔虾各期分别赋予一个值，即 1、2、3、4、5、6、7，表示幼体的发育阶段。

幼体存活率(SR) 根据文献［22］计算幼体存活率，表示幼体在各个发育阶段的存活情况，计算公式如下:

式中，Z1、Z2、…、Z6分别表示脊尾白虾溞状幼体各期存活的数量，P表示变态为仔虾的数量，20为放入幼体的初始数量。

1.2.4 个体干质量的测定

出现仔虾的第一天，从每个烧杯中取出3—5只仔虾放在20目的滤网上，用自来水冲洗后，用滤纸吸干水分，转移到已称重的锡箔制成的小杯子里，然后放入电热鼓风干燥箱内，在60℃下烘干6 h。烘干后在万分之一的电子天平上称量样品和杯子总重。仔虾个体干质量计算公式如下:

1.2.5 有效积温的计算

脊尾白虾受精卵孵化有效积温可通过以下双曲线公式计算［23-24］:

式中，K为脊尾白虾受精卵完成发育所需要的有效积温(时度，℃·h);N为发育历期，即孵化出溞状幼体所需要的时间(h);T为发育期的平均温度(℃);C为发育起点温度，即生物学零度(℃)。

将方程(1)可转换成:

式中，V为发育所需要时间的倒数(1/N)，即发育速度。

在 n 种实验温度(T1、T2、T3、…、Tn)下，分别观察和记录相应的发育时间 N1、N2、N3、…、Nn，将 N1、N2、N3、…、Nn换算成 V1、V2、V3、…、Vn，根据以下公式便可求出 C 和 K 值［24］。

1.2.6 显著性检验

实验数据采用SPSS软件统计分析。所有组间数据在进行显著性差异比较之前都用Kolmogorov-Smirnow Test在5%水平下检验均匀性。如果均匀性不好，则将数据化为对数或平方根后再用单因子方差分析(one way ANOVA)进行比较，Duncan multiple range test用来检验显著性差异(P＜0.05)。结果为百分数的先化为小数，然后开平方再转换成反正弦函数做统计分析。

2 实验结果

2.1 不同温度对脊尾白虾胚胎发育的影响

脊尾白虾胚胎发育时间或发育速度与温度的关系如表2，由表2数据可得到脊尾白虾胚胎发育的生物学零度和有效积温分别为12.18℃、3828.27℃·h。在15.3—28.1℃范围内胚胎发育时间随着温度的升高而呈双曲线性缩短，其关系可用一幂函数方程H=570880T－2.3434(R2=0.9906)表示(图1)，胚胎发育速度随着温度的升高而呈直线性加快(图1)。但当温度超过30℃时，胚胎发育受到抑制，受精卵大部分脱离母体腹部，不能顺利孵化出溞状幼体。

表2 脊尾白虾胚胎发育时间与温度的关系Table 2 Relationship between development time and water temperature in the embryonic development of Exopalaemon carinicauda

2.2 不同温度对脊尾白虾幼体变态发育的影响

各温度组幼体发育指数如表3所示，从孵化后第2天开始，不同温度组间就呈现出一定的差异，26℃和28℃组变态发育最快，均显著快于其它组(P＜0.05)。幼体孵化后第15天时，22℃和24℃两组发育指数均高于6.90，显著高于 18℃和 20℃两组(P＜0.05)。18—28℃各组开始出现仔虾的时间依次为17、14、11、9、8、8d，各组90%以上幼体变态为仔虾的时间依次为21、18、15、14、11、11d。

2.3 不同温度对脊尾白虾幼体发育成活率的影响

不同组别的幼体在实验期间的存活率见表4，各实验组在变态过程中存活率都呈明显的阶梯式下降趋势，其中T28组的存活率下降最快。到各组幼体全部变为仔虾时，T24组的存活率最高为92.00%，其次为T18、T22和 T26的88.00%，T20为 86.67%，T28组存活率最低为85.11%，但6组间的存活率无显著性差异(P＞0.05)。

2.4 不同温度对脊尾白虾仔虾体质量的影响

不同实验组仔虾个体干质量见图2，T18仔虾的干质量最大为 0.85 mg，与其它组差异显著(P＜0.05);T20—T28各组仔虾的干质量分别为 0.62、0.67、0.64、0.56和0.51 mg，T28仔虾的干质量最小，但该5组间无显著性差异(P＞0.05)。

图1 胚胎发育时间及其发育速度与温度的关系Fig.1 Relationship between time or rate and mean water temperature for embryonic development of Exopalaemon carinicauda

表3 不同温度下脊尾白虾幼体发育指数Table 3 Effect of temperature on the larval stage index of Exopalaemon carinicauda

表4 不同温度下脊尾白虾幼体存活率Table 4 Effect of temperature on the survival rate of larvae of Exopalaemon carinicauda

3 讨论

3.1 脊尾白虾胚胎发育生物学零度和有效积温

脊尾白虾属于抱卵繁殖，当受精卵粘附在母体腹肢后，母体已不再向受精卵输送营养，而盐度、温度、溶氧、pH值、重金属等环境因子则对胚胎发育有着重要的影响，因此在脊尾白虾育苗当中，应注重对水体环境因子的调控，特别是对温度的调控，对胚胎发育速度有着决定性作用。探明其胚胎发育的生物学零度及有效积温，可为人工控制幼体孵化提供理论依据，有计划地安排生产。本实验得到的脊尾白虾胚胎发育生物学零度为12.18 ℃，王桂忠等［25-27］研究得出东方扁虾(Thenus orientalis)、锈斑蟳(Charybdis feriatus)和拟穴青蟹胚胎发育的生物学零度分别为13.50、15.68℃和15.70℃，稍高于脊尾白虾;而吕佳等［18，28］报道克氏原螯虾和锯缘青蟹胚胎发育的生物学零度分别为5.60℃和11.70℃，稍低于脊尾白虾。这可能由于不同物种生活环境不同，繁殖季节对水温要求不同所致。脊尾白虾主要生活在浅海水域，其繁殖盛期在5—8月份，水温为12.5—26.8℃［2］，本实验得到的脊尾白虾胚胎发育生物学零度稍低于自然海区的水温，符合发育生物学的规律。因此在脊尾白虾育苗当中，受精卵孵化水温应不低于12.18℃，否则将影响其正常发育。在其他水质条件满足的前提下，脊尾白虾胚胎发育直至幼体孵化的有效积温是一定的，即一常数。本研究根据昆虫发生期预测的有效积温法，首次得出脊尾白虾胚胎发育理论有效积温为3828.27℃·h，可在一定范围内有效预测脊尾白虾胚胎完成整个发育周期所需的时间。

图2 不同温度下仔虾个体干质量Fig.2 Effect of temperature on the individual dry weight of the post-larva of Exopalaemon carinicauda

3.2 脊尾白虾胚胎发育与温度的关系

对变温动物而言，温度的高低对胚胎发育的速度有很大影响。在一定范围内，胚胎发育速度与温度的高低成正比，即温度越高，发育越快;温度越低，发育越慢［29］。本实验在水温15—28℃条件下，脊尾白虾受精卵随着孵化温度的升高，孵化时间逐渐缩短，这与长毛对虾、红螯光壳螯虾、日本沼虾、锯缘青蟹、克氏原螯虾等［16-17，28，30-31］受精卵孵化所需时间与温度呈一定的函数关系结论一致。本实验发现当孵化温度超过30℃时脊尾白虾受精卵大部分脱落于水体中，不能顺利孵化出幼体。如日本沼虾［30］在34℃时胚胎发育时间有延长趋势，而且在36℃时胚胎不能完成整个发育期;长毛对虾［16］在超过35.5℃时受精卵孵化受到抑制;东方扁虾［25］胚胎在34℃时离体培养，2—3 d后即表现出不适，约一周后呈解体状，在37℃培养1—2 d后即全呈解体状。说明每种虾的胚胎发育都有一个温度耐受范围，而这一范围一般小于其存活的适温范围，当水体温度超出其胚胎耐受范围时，胚胎发育将受到抑制，这可能是由于高温度导致胚胎内某些酶的活性丧失或被抑制，从而造成新陈代谢的紊乱，最终使胚胎死亡［30］，也可能是由于高温使脊尾白虾抱卵刚毛粘附性受到了影响，卵之间的卵柄连接变弱直至分离，散落于水体底部后失去了母体腹肢搅动水体供氧途径，最终因缺氧无法进行新陈代谢而死亡，但具体原因仍需进一步深入研究。

虾蟹类胚胎发育是一个动态的生理生化变化过程。卵黄物质作为胚胎发育的主要营养来源，其水解形成的蛋白质和氨基酸，一方面为胚胎生理代谢提供能量，另一方面为胚胎组织器官的形成提供必需的物质［32］。研究显示，卵黄蛋白在罗氏沼虾、日本沼虾、红螯光壳螯虾、中华绒螯蟹和锯缘青蟹等胚胎发育过程中总体呈直线下降趋势，而氨基酸呈抛物线下降趋势，但随着胚胎的发育能量消耗却显著增加，这也说明卵黄物质不断进行着异化和同化作用，一部分为胚胎发育提供能量，另一部分则用于组织分化和器官的形成［32-35］，Babu［36］认为蛋白质尤其在角质层、肌肉、消化和神经系统形成中发挥着重要作用。

而在胚胎发育过程中，卵黄物质的分解和利用与各种酶类密切相关，是通过各种消化酶的水解作用为胚胎发育提供能量和构建胚胎组织、器官［37］。研究表明，胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂酶在虾蟹胚胎各个时期均有活性，而且酶的活性高低与蛋白质含量的变化呈一定的相关性［34，37］。然而这一系列反应过程通常需要适宜的温度条件，温度对于胚胎发育过程中各种酶活的影响，将直接影响到营养物质的同化和异化作用速率，从而影响孵化时间。作者推测，在脊尾白虾胚胎发育中同样也存在着在各种酶催化作用下所发生的一系列反应，而在不同温度下酶促反应速率也不同，从而表现出胚胎发育速率的差异。

3.3 脊尾白虾幼体变态发育与温度的关系

虾蟹幼体发育一个阶段则经历一次蜕皮，而其蜕皮主要是受内分泌激素如蜕皮激素和蜕皮抑制激素等共同作用的结果［38］，其中胆固醇是蜕皮激素生物合成中一种重要的前体物，研究发现真蟹蜕皮时Y-器官对胆固醇的含量大大增加，黄道蟹蜕皮前后血液中的胆固醇活性也显著增加［39］。但从胆固醇到蜕皮激素的转化是一系列复杂的生化反应，主要是在细胞色素P450(CYP450)酶的催化作用下最终合成蜕皮激素，然后再与蜕皮激素受体结合，在热休克蛋白90(HSP90)、热休克蛋白70(HSP70)和蜕皮激素诱导因子E75等分子伴侣蛋白的协同下级联放大蜕皮信号，最终促进蜕皮［40-42］。因甲壳动物自身不能合成胆固醇，所以必须从外界摄取足够的胆固醇才能保证正常变态发育［43］，本实验中脊尾白虾幼体饵料为卤虫无节幼体，富含胆固醇［44］，因此在脊尾白虾幼体摄取足够胆固醇的条件下，随着温度的升高，CYP450酶的活性也随之增强，从而增加了胆固醇转化为蜕皮激素的效率，同时在较高温度下HSP90等蛋白协同作用增强，加速了对蜕皮信号的传递、放大，从而表现出蜕皮频率的加快。

幼体蜕皮过程也是物质能量消耗的过程，幼体从摄食饵料中积累能量和重要营养物质是与蜕皮周期内分泌调控相互作用的一个重要外源因子［38］，Anger和Dawirs［45］提出幼体能进入蜕皮周期的某一点，关键在于幼体已积累了足够的能量或营养。因此在蜕皮前需积累一定的营养物质，而营养物质的吸收利用与各种消化酶密切相关，消化酶活力的高低决定着幼体对营养物质消化吸收能力，从而影响幼体生长发育速度［15］。在虾蟹类幼体中普遍存在胃蛋白酶、类胰蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶5种消化酶，而这些酶活力与温度有直接的关系，酶活力的适宜温度也正是幼体生长发育的适宜温度［46-49］。潘鲁青［15］报道在22—25℃，中国对虾溞状幼体胃蛋白酶、类胰蛋白酶和淀粉酶3种酶的活力较高，因此选择此温度为中国对虾溞状幼体培育的最佳温度。本实验结果表明，在一定温度范围内脊尾白虾幼体的变态发育速度随着温度的升高而加快，与潘鲁青、施流章、邢克智、Villarreal和Kumlu［15-16，50-52］等研究结果一致。但当超出26℃时，脊尾白虾幼体的发育速度已不再加快，而22℃时的发育速度明显快于18℃和20℃，这可能是由于22—26℃是幼体体内消化酶最适宜的温度，加快了幼体对营养物质的吸收利用，为幼体变态发育提供了足够的物质能量。因此建议脊尾白虾幼体培育最佳温度控制在22—26℃。

3.4 脊尾白虾仔虾存活率和个体质量与温度的关系

在本实验条件下，随着幼体发育，成活率成阶梯式下降，说明幼体死亡率主要发生在幼体蜕皮时期，因每次蜕皮前后幼体形态结构发生了质的变化，因此也是死亡率高峰期，但各组幼体全部变为仔虾时的存活率无显著性差异，这也说明随着温度的升高只是加快了幼体发育速度。到各温度组全部幼体变为仔虾时，18℃组仔虾的个体干质量最大，这可能是由于幼体从外界摄取一定数量的能量后，首先用于满足蜕皮需要的蜕皮能，更多的食物能量摄取才用于摄食后的生长［53］，而在较低温度下幼体变态间隔时间较长，因此在其体内储存了更多的营养物质而用于生长。

4 小结

实验结果表明，脊尾白虾胚胎发育的生物学零度为12.18℃，有效积温为3828.27℃·h。胚胎在15—28℃均能顺利孵化出幼体，约需41—10 d，温度越高孵化所需时间越短，但最高不应超高过30℃;脊尾白虾溞状幼体在18—28℃均能顺利变态到仔虾，结合发育速度和存活率等指标综合考虑，建议最佳培育温度控制在22—26℃。

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