白藜芦醇对高脂血症大鼠多种抗氧化系统的影响

邓祖跃，匡 荣，朱社敏，王 丹，康 桦，赵 嘉

(浙江省食品药品检验研究院，浙江杭州 310004)

近年研究已证实白藜芦醇(resresveratrol，Resv)具有抗肿瘤、抗氧化、抗心血管疾病等作用［1］。Resv抗氧化作用的研究主要集中在其对超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的影响，但Resv对其他抗氧化作用影响的研究较少，本次实验我们观察了白藜芦醇对L-Arg-NO途径及HDL的抗氧化成分——对氧磷酶1(paraoxonase-1，PON1)的表达和活性影响，以便更深入了解白藜芦醇的抗氧化作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 白藜芦醇购买于中美华东制药有限公司(98%，HPLC)，实验时用二甲基亚枫(DMSO，Sigma)溶解后蒸馏水配制为所需的浓度，其中DMSO质量分数不超过2%。总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等检测试剂盒［德赛诊断系统(上海)有限公司］。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮(NO)、内皮一氧化氮合酶(eNOS)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);PON1测定ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);TRIzol、逆转录酶、PCR试剂盒(TaKaRa公司)。

1.2 仪器 日立7020全自动生化分析仪(日本，日立公司)，PCR扩增仪(美国，Bio-rad公司)，多功能酶标仪(美国，Molecular Devices公司)。

1.3 实验动物及分组 健康♂SD大鼠30只，清洁级，平均体质量200～250 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［动物合格证号:SCXK(沪)2007-0005］。平衡饮食1周后随机分组，①正常对照组:饲正常饲料，并灌胃给药(intragastric administration，ig)给予0.9% 氯化钠注射液(4 ml·kg－1·d－1)。②高脂饲料模型组:饲高脂饲料(high fat diet，HFD)，并 ig 给予 0.9% 氯化钠注射液(4 ml·kg－1·d－1)。③高脂饲料白藜芦醇组:饲高脂饲料，并ig给予白藜芦醇(50 mg·kg－1·d－1)。常规饮水，连续给药 45 d。

1.4 样本采集 末次给药后次日，大鼠乙醚麻醉后，心脏取血，制备血浆，－20℃保存备用。取大鼠肝组织，立即投入液氮中保存。

1.5 生化指标测定 全自动生化分析仪测定血浆TG、TC、LDL-C及HDL-C的含量。多功能酶标仪测定血浆中MDA、NO 、PON1的含量及SOD、GSH-Px、eNOS的活性。

1.6 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠肝组织PON1 mRNA的表达 RT-PCR按TRIzol试剂盒说明书抽提肝组织总 RNA，紫外测定 OD260/OD280的比值(在1.8～2.0之间)。然后按逆转录酶说明书将RNA逆转录成cDNA，以合成好的cDNA为模板进行PCR扩增反应。PON1:上游引物5'-TGCTGGCTCACAAGATTCAC-3'，下游引物5'-AGCAGCGACTGTCGTACCTT-3'，扩增产物长度为 287 bp。GADPH:上游引物5'-GCATGGCCTTCCGTGTTCC-3'，下游引物5'-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3'，扩增产物长度为337 bp。PCR反应条件为:预变性94℃ 3 min，变性94℃40 s、退火53℃ 60 s、延伸72℃ 60 s、循环32轮 后，72℃延伸5 min，4℃ 保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离，并应用凝胶成像系统分析，以目的片段PON1带的灰度与内参照GAPDH带的灰度之比表示PON1mRNA的表达水平。

1.7 血浆PON1活性测定 参照文献［2］，在25℃下用270 nm分光光度仪测定的血浆PON1活性。

2 结果

2.1 白藜芦醇对大鼠血浆血脂含量的影响 与HFD组比较，白藜芦醇组大鼠血浆TC及LDL-C含量均明显下降，而HDL-C明显升高(P＜0.01)(Tab 1)。

2.2 白藜芦醇对高脂血症大鼠血浆 NO、MDA含量及eNOS、SOD、GSH-Px活力的影响 与HFD组比较，白藜芦醇使大鼠血浆SOD、GSH-Px及eNOS活力及NO含量均明显升高(P＜0.01)，MDA含量降低(P＜0.01)(Tab 2)。

Tab 1 Effects of Resv on TG，TC，HDL-C and LDL-C in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

Tab 1 Effects of Resv on TG，TC，HDL-C and LDL-C in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HFD group

Group TG/mmol·L －1 TC/mmol·L －1 LDL-C/mmol·L －1 HDL-C/mmol·L －1 Control HFD HFD+LP 0.77 ±0.31 0.84 ±0.32 0.83 ±0.35 1.91 ±0.16 4.44 ±0.83＊＊2.94 ±0.24##2.64 ±0.29 6.24±0.48＊＊3.62 ±0.27##3.34 ±0.22 2.48 ±0.26＊＊3.42 ±0.23##

2.3 白藜芦醇对大鼠血浆PON1的含量及活性、肝组织PON1 mRNA表达的影响 与HFD组比较，白藜芦醇使血浆PON1含量升高、活性增加，肝脏 PON1 mRNA表达上调(P＜0.01)(Tab 3)。

Tab 2 Effects of Resv on NO，MDA contents and the activities of eNOS、SOD and GSH-Px in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

Tab 2 Effects of Resv on NO，MDA contents and the activities of eNOS、SOD and GSH-Px in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HFD group

Group SOD/kU·L－1 GSH-Px/kU·L－1 MDA/μmol·L－1 NO/μmol·L－1 eNOS/kU·L －1 Control HFD HFD+LP 104.72 ±19.33 40.23 ±14.25＊＊82.98 ±25.31##431.30 ±65.02 356.76 ±67.12＊＊393.78 ±45.16##4.18 ±1.51 7.43 ±1.49＊＊4.47 ±1.24##38.74 ±5.34 31.54 ±5.40＊＊36.34 ±5.14##46.07 ±4.56 36.17 ±6.23＊＊45.31 ±7.28##

Tab 3 Effects of Resv on PON1 content，PON1 mRNA expression and its activity in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

Tab 3 Effects of Resv on PON1 content，PON1 mRNA expression and its activity in rats fed on high fat diet or normal diet(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HFD group

Group PON1contents/mg·L－1 PON1mRNA PON1 activity/μmol/min·L －1 Control HFD HFD+LP 1.27 ±0.14 0.54 ±0.06＊＊0.83 ±0.08##2.28 ±0.14 1.83 ±0.13＊＊2.43 ±0.14##54.87 ±10.91 28.78 ±10.49＊＊61.42 ±12.23##

3 讨论

髙脂状态下，血脂升高，自由基生成增加，大量的自由基能破坏机体的氧化系统平衡，导致脂蛋白发生氧化修饰，其中ox-LDL对内皮细胞具有很强的细胞毒性作用，造成内皮损伤。损伤的内皮细胞线粒体产生过多的过氧化物，这些过氧化物可减少eNOS的表达、抑制L-精氨酸/一氧化氮(LArg-NO)途径，减少NO产生并使NO清除速度加快、生物学作用减低［3］。损伤的内皮使血液中的单核细胞及氧化脂蛋白更容易进入内皮下层，形成泡沫细胞和致动脉粥样硬化(AS)。本次实验中，白藜芦醇降低了高脂大鼠血浆TC及LDL-C含量，消除了血脂升高引起的自由基活化，减少了受攻击的脂蛋白量，降低了致AS的启动因素。同时具有多酚结构的白藜芦醇通过清除自由基，增加SOD及GSH-Px活力，降低MDA含量，增加了体内抗氧化能力［4］。另外，白藜芦醇降低了ox-LDL产生，保护了血管内皮，保护并提高了eNOS活力，提高了NO产生，而NO可和其它游离自由基结合产生反应，从而使体内自由基数量大大减少。

HDL抗AS作用除了其胆固醇逆向转运功能外，还具有抗氧化作用，而其抗氧化作用主要由 PON1主导，目前认为PON1活性可能成为HDL-C抗AS保护作用的新的有效标志物［5］。白藜芦醇增加大鼠血浆HDL-C、PON1的含量及 肝组织PON1mRNA的表达，血浆PON1活性增高，说明白藜芦醇可能通过增加HDL-C含量来增加PON1含量、同时上调PON1mRNA的表达及提高PON1的活性使HDL-C的抗氧化功能增强。

简言之，白藜芦醇通过降血脂，提高抗氧化酶系统，活化L-Arg-NO途径，增加PON1的表达及活性提高机体的抗氧化能力，从而实现抗AS作用。

［1］Pervaiz S，Holme A L.Resveratrol:its biologic targets and functional activity［J］.Antioxid Redox Signal，2009，11(11):2851－97.

［2］Rozenberg O，Rosenblat M，Coleman R，et al.Paraoxonase(pon1)deficiency is associated with increased macrophageoxidative stress:studies in PON1 knock out mice［J］.Free Radic Biol Med，2003，34(6):774－84.

［3］Humar K，Hazelrigg S R.Oxidative injury due to chronic nitric oxide synthase inhibition in rat:effect of regular exercise on the heart［J］.Biochim Biophys Acta，2002，1587(1):75－82.

［4］Pendurthi W R，Williams J T，Rao L V，et al.Resveratrol，a polyphenoliccompound found in wine.inhibits tissue factor expression in vascularcells:A possible mechanismfor the cardiovascular benefits associated with moderate consumption of wine［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1999，19(2):419.

［5］Tomas M，Latorre G，Senti M，et al.The antioxidant function of high-density lipoproteins:a new paradigm in atherosclerosis［J］.Rev Esp Cardiol，2004，57(6):557－69.