抗氧化肽SS-31对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响

王月华，侯延娟，任韫卓，韦金英，杜春阳，张连珊，史永红

(河北医科大学病理学教研室，河北石家庄 050017)

高血糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发病过程中发挥重要作用，其造成的系膜细胞缺失是导致糖尿病肾损伤的主要机制［1－2］。高血糖引起的活性氧 (reactive oxygen species，ROS)产生对DN的发展具有至关重要的作用［3］。高糖(high glucose，HG)通过诱导ROS产生促进肾小球系膜细胞凋亡［1］。研究表明，ROS产生的主要部位是线粒体，在糖尿病血管并发症中发挥重要作用［4］。SS-31 肽(D-Arg-2’，6’-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2)属于小分子可渗入细胞的肽家族，能够靶向定位和聚集在线粒体内膜［5］。SS-31能够清除细胞内ROS和抑制线粒体ROS产生，从而防止线粒体通透性改变和细胞色素C释放［5］。以往的研究表明，SS-31能够抑制单侧输尿管梗阻大鼠肾小管上皮细胞凋亡和肾小管损伤［6］。最近研究显示，SS-31能抑制高糖诱导的人视网膜内皮细胞凋亡和线粒体ROS的产生、稳定线粒体膜电位、减少细胞色素C由线粒体向胞质释放和caspase-3表达［7］。然而，SS-31对 HG诱导的肾小球系膜细胞的凋亡作用还未见报道。本实验旨在探讨抗氧化肽SS-31对HG诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡的作用以及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠系膜细胞(CRL-1927)来自美国菌种保藏中心(Manassas，VA)。D-glucose和Mannitol为 Sigma公司产品。兔抗 cleaved caspase-3、p38 MAPK、p-p38 MAPK为美国 Cell Signaling公司产品。小鼠抗 Bax单克隆抗体(P-19)，兔抗 Bcl-2、caspase-3和细胞色素C多克隆抗体以及ECL增强化学发光试剂盒为美国Santa Cruz公司产品。TUNEL试剂盒为美国Promega公司产品。SS-31多肽由上海强耀生物科技有限公司合成。辣根酶标记羊抗小鼠或兔IgG购自北京中杉金桥公司。聚偏二氟乙烯膜(PVDF)为美国Milipore公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组刺激实验 以含体积分数0.1胎牛血清，2 mmol· L－1L-谷氨酰胺，100 kU·L－1青霉素和 100 mg·L－1链霉素的 DMEM-F12(3∶1)培养基常规培养细胞。待MMCs达75% ～85%融合后，用无血清培养基同步24 h。同步后的细胞分成4组:正常糖组(5.6 mmol·L－1葡萄糖，NG);正常糖+甘露醇组(5.6 mmol· L－1葡萄糖+24.4 mmol·L－1甘露醇，M);高糖组(30 mmol· L－1葡萄糖，HG)，高糖 +SS-31 组(30 mmol· L－1葡萄糖 +100 nmol·L－1SS-31，HG+SS-31)。于刺激 48 h后收集细胞观察。

1.2.2 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡 收集上清及贴壁细胞，用PBS洗2次，用体积分数0.70的乙醇4℃固定24 h，PBS洗2次，碘化丙啶避光染色30 min，流式细胞仪观察。

1.2.3 末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡 MMCs接种于8孔Lab-Tek®腔室玻片(美国Nalge Nunc公司)上，分组刺激48 h。根据说明书使用DeadEndTM荧光TUNEL系统检测细胞凋亡。荧光显微镜下计数每个高倍视野中阳性染色细胞数和总细胞数，计算阳性细胞百分比。

1.2.4 Western印迹检测 细胞用冰冷PBS洗2遍，加入细胞裂解液(25 mmol·L－1Tris-HCL，10 mmol·L－1EDTA，体积分数 0.01 NP-40，150 mmol·L－1氯化钠，质量浓度 1 g·L－1苯甲基磺酰氟)，冰浴 1 h，4 ℃、14 000 r·min－1离心 25 min，Lowry法测定上清液蛋白浓度。按照Huang等［8］所述方法分离线粒体和不含线粒体的胞质蛋白，本次实验使用不含线粒体的胞质蛋白。细胞裂解蛋白50 μg，经十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳后电转移至PVDF膜;质量分数0.05的脱脂奶粉封闭 PVDF膜 2 h，分别加入 caspase-3、cleaved caspase-3、p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bax、Bcl-2以及细胞色素C抗体，4℃过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或兔抗体(1∶5 000稀释)，37℃孵育1.5 h;洗膜后加ECL试剂，然后将PVDF膜放入X线片暗盒，压片，显影，定影。用美国UVP公司LabWorks 4.5分析系统软件对Western条带进行定量分析。

1.2.5 流式细胞术(FCM)检测细胞内ROS 使用荧光探针5-(6)-羧基-2，7-二氯荧光素(CM-DCHFDA，Invitrogen)检测细胞内ROS含量。MMCs接种于6孔板内，分组刺激48 h，洗涤细胞，胰酶消化，悬浮于 PBS，最后加入含 10 μmol·L－1DCHF-DA 的染液中，37℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 SS-31对高糖诱导的系膜细胞凋亡的影响TUNEL和流式细胞术检测结果表明，与NG组相比，在高糖刺激48 h，小鼠系膜细胞凋亡细胞数明显增加(P＜0.01);与HG组相比，SS-31干预能够明显减少高糖诱导的细胞凋亡数 (P＜0.05，Fig 1，2)。此外，甘露醇对细胞凋亡无影响。

2.2 SS-31对高糖诱导的系膜细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与NG组相比，HG糖组cleaved caspase-3表达和 Bax/Bcl-2比率明显增加(P＜0.01);SS-31干预能够明显抑制HG诱导的cleaved caspase-3表达和Bax/Bcl-2比率(P＜0.05，Fig 3)。此外，甘露醇对系膜细胞cleaved caspase-3表达和Bax/Bcl-2比率无影响。

2.3 SS-31对HG诱导的系膜细胞线粒体细胞色素C释放的影响 亚细胞提取物的Western blot结果显示:HG刺激系膜细胞48 h，与正常糖对照组相比，高糖组胞质中的细胞色素C水平明显增加(P＜0.01);与高糖组相比，SS-31干预组细胞胞质中细胞色素C水平明显降低(P＜0.05，Fig 4)。甘露醇组与正常对照组相比，胞质中细胞色素C水平无差异。

Fig 1 Effect of SS-31 on HG-induced apoptosis of MMCs(analyzed by TUNEL，n=6).

Fig 2 Effect of SS-31 on HG-induced apoptosis of MMCs(analyzed by TUNEL，n=6).

Fig 3 Effect of SS-31 on activation of caspase-3 and expression of Bax and Bcl-2 in MMCs(n=6).

Fig 4 Effect of SS-31 on the release of cytochrome C from mitochondria to cytoplasm in MMCs(n=6).

2.4 SS-31对HG诱导的系膜细胞ROS产生的影响 流式细胞术结果显示:HG刺激系膜细胞48 h，与正常糖对照组相比，高糖组系膜细胞ROS产生明显升高(P＜0.01);SS-31干预组细胞ROS表达明显低于高糖组(P＜0.05，Fig 5)。甘露醇组与正常对照组相比，ROS水平无差别。

2.5 SS-31对HG诱导系膜细胞p38 MAPK激活的影响 在高糖刺激的48 h，与NG组相比，HG组p38 MAPK的磷酸化水平明显升高(P＜0.01);与高糖组相比，SS-31干预组p38 MAPK磷酸化水平明显降低(P＜0.05，Fig 6)。甘露醇组与正常对照组相比，p38 MAPK磷酸化水平无差异。

3 讨论

既往的研究已证实，在糖尿病时，肾脏存在大量ROS的蓄积，破坏了肾脏组织内氧化还原动态平衡，造成肾组织的氧化应激状态，参与肾损伤的发生与发展［9］。多种对实验性糖尿病肾病具有肾脏保护药物都具有降低肾脏氧化应激状态的作用［10－12］。因此，调节糖尿病肾脏氧化应激状态有可能成为有效的治疗糖尿病肾病的靶点。

Fig 5 Effect of SS-31 on HG-induced ROS production in MMCs(detected by flow cytometry，n=6).

研究表明，实验性糖尿病肾病肾小球固有细胞数量可通过细胞凋亡而减少，并且肾小球系膜细胞凋亡数与蛋白尿的程度密切相关［13］。高糖诱导的系膜细胞凋亡和系膜缺失是导致糖尿病患者肾脏损伤的一个主要机制［1－2］。高糖能够明显诱导体外培养系膜细胞的凋亡，而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、二亚苯基碘(DPI)及维生素C能够明显抑制高糖诱导的小鼠系膜细胞的凋亡［1］。我们的最近的研究也证实，抗氧化剂tempol以及敲低硫氧还蛋白抑制蛋白(TXNIP)表达均能够抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡［14］。本研究结果显示，高糖能够明显促进系膜细胞ROS产生，同时伴有细胞凋亡增加，cleaved caspase-3表达和Bax/Bcl-2比率升高以及促使细胞色素C从线粒体释放入胞质。以上提示，高浓度葡萄糖诱导的系膜细胞凋亡和ROS产生密切相关。

Fig 6 Effect of SS-31 on HG-induced activation of p38 MAPK in MMCs(n=6).

SS-31肽是一种线粒体靶向肽，能够选择地集中在线粒体内膜并降低线粒体ROS产生［6］。最近的研究证实SS-31具有明显的抗氧化和抗凋亡作用。Thomas等［15］的研究表明，SS-31容易渗入胰岛细胞，防止线粒体去极化，减少细胞凋亡，增加胰岛细胞数，改善胰岛移植后的功能。在大鼠缺血/再灌注肾损伤模型，SS-31能够加速细胞ATP恢复，减少肾小管细胞凋亡和坏死，减少氧化应激和炎症反应，并防止肾小管功能障碍［16］。本研究结果显示，SS-31干预能够抑制HG诱导的MMCs内ROS产生，细胞凋亡，cleaved caspase-3表达，Bax/Bcl-2比率和细胞色素C的易位。这些结果表明，SS-31抑制HG诱导的系膜细胞凋亡可能是通过减少ROS和保护线粒体功能实现的。

p38蛋白激酶(p38 MAPK)为丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，是一个重要的信号分子，参与调控包括细胞凋亡在内的许多细胞功能。Jun等［17］的研究显示，给予FR 167653(一种p38 MAPK抑制剂)，能够抑制糖尿病肾小球细胞和体外HG诱导的系膜细胞凋亡。我们的研究表明，采用SB203580阻断p38 MAPK通路能够明显抑制HG诱导的系膜细胞凋亡，cleaved caspase-3 表达和 Bax/Bcl-2 比率［14］。以上说明，p38 MAPK信号通路可能与系膜细胞凋亡密切相关。有研究表明N-乙酰半胱氨酸能够抑制顺铂诱导的肾脏细胞凋亡及p38 MAPK信号通路的活化，提示N-乙酰半胱氨酸的抗凋亡作用可能与抑制p38 MAPK信号通路的活化有关［18］。本研究中我们发现，SS-31能够明显抑制 HG诱导的 p38 MAPK的活化，提示SS-31抑制HG诱导的MMCs凋亡可能部分是通过调节p38 MAPK通路活化实现的。

综上所述，SS-31能够抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞的凋亡，这种作用可能是通过减少ROS产生，保护线粒体功能以及抑制p38MAPK信号通路的活化实现的。

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