江团吉氏柠檬酸杆菌的鉴定及药敏试验

龙钟明，王 利，苟小兰，刘港彪，冀国帧，韦 璇

（西南民族大学生命科学与技术学院，动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室，四川 成都 610041）

目前，国内外对江团研究报道得较少，主要集中在江团池塘养殖和养殖营养需求等方面，对江团的细菌性疾病鲜见报道。吉氏柠檬酸杆菌为柠檬酸杆菌属细菌，革兰氏阴性，需氧或兼性厌氧。近年来，国外研究者已在人及水生动物中报道了吉氏柠檬酸杆菌。国内尚缺乏对该菌的研究。本文笔者通过生理生化实验、16S rDNA序列分析和构建系统发育树，对江团吉氏柠檬酸杆菌进行了分离鉴定，并进行了药敏试验，旨在为江团细菌性病原的鉴定和防治以及江团资源的保护和利用积累科学资料。

1 材料与方法

1.1 材料 发病江团来自四川某养殖场。江团体长7 cm，21g，体表黏液较多，胸鳍、腹鳍基部充血，肛门轻微红肿。主要试剂：SS琼脂培养基、营养琼脂、生化鉴定药品和药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司。TaqMix、DNA MarkerDL2000 等 购 自 TIANGEN BIOTECH（BEIJING）公司。

1.2 细菌的分离和菌落形态观察 无菌操作取江团心脏等组织，划线接种到营养琼脂和SS琼脂培养基上，30℃培养12h。待平板长出单一菌落后，挑选单个菌落划线纯化，纯化菌株于4℃保存。将纯化菌株分别划线接种到MC、SS、营养琼脂中观察菌落形态。

1.3 生理生化鉴定 将纯化菌穿刺接种到细菌生化特性鉴定管中，进行H2S、动力性、尿酶、柠檬酸盐利用、糖类等理化特性测定。根据《伯杰氏系统细菌学手册》对菌株进行鉴定。

1.4 16S rDNA基因序列分析

1.4.1 基因的扩增和测序 模板制备：取一EP管加入100μL灭菌ddH2O，挑取枪头大小的经过24h培养的细菌菌落于灭菌ddH2O中，制成悬液，置-80℃冻存1h后，迅速置入沸水浴中20min，然后12000r/min离心5min，取上清作为细菌粗提模板，-20℃保存备用。采用细菌16S rDNA通用引物（正向引物：AGAGTTTGATCCTGGC TTAG，反向引物：ACGGCTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系：上游引物1.0μL，下游引物1.0μL（引物浓度均为 10μmol/L），ddH2O 25μL，2×Taq PCR MasterMix 20 μL，模板 3.0 μL，总体系为 50 μL。PCR 反应条件：94℃预变性 4 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 4 min，5 个循环；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 4 min，5 个循环；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 4min，30个循环。PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，将阳性样品送交北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

1.4.2 系统发育树的构建 利用Blastn程序对菌株JT-0603 16S rDNA序列进行同源性检索，找出相似性最高的菌种及同属菌种作为内群，另外选取柠檬酸属的布氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和气单胞菌属的维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌等几种细菌作为外群。用ClustalX2软件进行多序列全局比对，利用MEGA5.0软件，Neighbour-Joining方法，采用Kimura 2-parameter校正模型，自举1000次构建系统发育树。

1.5 药敏试验 药敏试验采用K-B法，挑取待检细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，调到0.5个麦氏标准，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液均匀涂布于MH琼脂平板，再贴上药敏纸片，28℃培养18 h后，观察并测量抑菌圈大小。

2 结果

2.1 菌落形态 在营养琼脂上的菌落直径一般为2～4 mm，光滑、低凸、湿润、半透明或不透明，灰色，表面有光泽，边缘整齐。革兰氏阴性，单个或成对，直杆菌。

2.2 生化鉴定 该细菌主要的理化特性为具有动力性，不发酵侧金盏花醇、山梨醇、木糖等；葡磷胨水、蛋白胨水、赖氨酸、尿素、鸟氨酸、苯丙氨酸等呈阴性反应；硫化氢、柠檬酸盐、葡萄糖产气、葡萄糖酸盐呈阳性反应，其生化特性见表1。参照《伯杰氏系统细菌学手册》，初步判断该菌为吉氏柠檬酸杆菌。

表1 菌株JT-0603生化试验结果

2.3 16S rDNA序列分析 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，结果见图1。经测序分析，16S rDNA序列片段大小为1 446 bp，将此序列提交至 GenBank，收录号为JN571748。测序结果比对分析显示，该细菌的16S rDNA与GenBank中吉氏柠檬酸杆菌不同分离株的相似性最高达97%。选取相似度较高的菌株及相关菌株运用ClustalX2、MEGA5.0构建系统进化树，结果见图2。分离菌株（图中以“◆”标记）与吉氏柠檬酸杆菌DQ23881.1、吉氏柠檬酸杆菌NR041697.1等聚为一簇，且Bootstrap检验值达67，可以初步确定该菌株为吉氏柠檬酸杆菌。

2.4 药敏试验结果 药敏试验表明，菌株JT-0603对环丙沙星、磺胺异恶唑、痢特灵、氟哌酸、链霉素、氟苯尼考、恩诺沙星等药物高度敏感；对强力霉素、氨苄青霉素低度敏感；对红霉素耐药。结果详见表2。

图1 16S rDNA PCR扩增结果

图2 菌株JT-0603 16S rDNA系统发育进化树

表2 菌株JT-0603药敏试验结果

3 分析及结论

3.1 Brenner等对112株柠檬酸杆菌进行了DNA杂交试验，并进行了分类，其中除吉氏柠檬酸杆菌外，还包含有弗氏柠檬酸杆菌、科氏柠檬酸杆菌、法氏柠檬酸杆菌等11个基因种。对于多数柠檬酸杆菌株而言，柠檬酸盐可作为唯一碳来源。弗氏柠檬酸杆菌是以柠檬酸盐为唯一碳源，但是一些吉氏柠檬酸杆菌却不能利用柠檬酸盐，JT-0603菌株表现为阳性。赖氨酸不能被脱羧基。鸟氨酸能被布氏柠檬酸、法式柠檬酸等利用，但是不能被吉氏柠檬酸等脱羧基化。柠檬酸属只有柯氏柠檬酸才发酵侧金盏花醇。弗氏、布氏和杨氏柠檬酸杆菌等能在加有硫化氢的克氏双糖铁琼脂和三糖铁琼脂培养基上生长，而菌株JT-0603也表现为阳性。右旋葡萄糖能被大部分的柠檬酸杆菌用来产酸产气。本试验菌株JT-0603的生理生化特性基本符合吉氏柠檬酸杆菌的特性。

3.2 16SrRNA为核糖体RNA的一个亚基，而16SrDNA是编码该亚基的基因。16S rDNA普遍存在于各种细菌中。16S rDNA由保守区和可变区交错排列组成。保守区为所有细菌所共用，而可变区可以用来区分不同的细菌。由于16S rDNA具有保守区和特异区并存的特点，使其在病原菌的临床检测中具有筛选和鉴别的双重作用。用此方法已鉴定出弗氏柠檬酸杆菌、赛氏柠檬酸杆菌。本试验通过16S rDNA基因序列分析，构建系统进化树，证明了菌株JT-0603为吉氏柠檬酸杆菌，从而也印证了16S rDNA基因分析是进行细菌鉴定的有效方法。

3.3 本研究药敏试验结果显示，菌株JT-0603仅对红霉素耐药。红霉素是国家禁用药物，应严格禁止滥用，也可能是该菌具有红霉素的抗性基因。本菌株对氨苄青霉素、强力霉素等临床上常用的抗生素低度敏感，这可能与养殖户过度使用这些抗生素有关。在水产养殖生产中，要慎重使用抗生素，防止细菌耐药性的产生与加重，避免滥用药物对养殖环境造成污染。而一旦发生疾病，应及时诊断，使用国家允许的渔用药物治疗。如果鉴定出吉氏柠檬酸杆菌为病原菌，可以根据药敏试验结果，采用敏感性药物进行治疗，从而减少疾病造成的损失。

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