猪口蹄疫、猪瘟、高致病性蓝耳病三种疫苗不同组合同时分点免疫的效果观察

孟丽军 ，杨晓玲 ，江文明 ，李云祝 ，孟坤武 ，胡安都

（1.四川省大竹县动物疫病预防控制中心，四川 大竹 635100；2.四川省大竹县畜牧食品局，四川 大竹 635100）

近年来，有很多地区针对猪瘟、猪口蹄疫、高致病性蓝耳病这3种疫苗的免疫程序及联合免疫效果进行了研究，各研究结果不尽一致。近期，四川大竹县高致病性蓝耳病的免疫抗体效价较低，是与同时注射不同疫苗有关，还是与先后注射不同疫苗的顺序有关，尚缺乏试验检测的数据。为了准确评估3种疫苗联合免疫后的效果及安全性，降低基层免疫工作强度和提高猪群的免疫抗体水平，本研究针对四川省大竹县本地情况就3种疫苗的免疫程序进行研究，以优化该县的免疫程序。

1 材料与方法

1.1 试验动物 选取大竹县竹北乡某猪场40～50日龄未经任何疫苗免疫的仔猪133头作为试验猪，免疫前对试验猪进行3种病毒（猪瘟、口蹄疫、蓝耳病）的基础抗体滴度测定，得出：高致病性蓝耳病病毒抗体阴性，口蹄疫感染抗体阴性，猪瘟感染抗体阴性。3种病毒的免疫抗体滴度均低于1∶16，适合作为试验对象。

1.2 试验疫苗 猪O型口蹄疫灭活苗，生产批号：A110104J，生产厂家：中农威特生物科技股份有限公司。政府采购猪瘟活疫苗（传代细胞苗），生产批号：1030，生产厂家：广东永顺生物制药有限公司。高致病性蓝耳病灭活苗，生产批号：201012003，生产厂家：北京信得威特科技有限公司。

1.3 检测试剂及检测卡 检测猪瘟、O型口蹄疫及高致病性蓝耳病的抗体试剂盒和抗体快速金标检测卡均购自深圳市某生物科技有限公司。

1.4 实验仪器及器械 高速台式离心机TGL-16B，微量振荡器ZW-A，电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070，酶标仪DNM-9602，单道/多道各种量程移液器，优普超纯水机UPT-II-5T，冰柜BCD-208；20mL金属注射器，0.9号的兽用采血器，猪保定器，记号笔等。

1.5 试验场地与饲养管理要求 试验地设在大竹县竹北乡某猪场，附近无其他猪舍，各组单独一圈，隔离饲养，饲喂相同饲料，整个试验场地封闭管理，固定饲养人员，严格消毒，杜绝无关人员出入。

1.6 试验分组 将133头仔猪随机分成7组：第1组18头，注射猪O型口蹄疫灭活苗；第2组19头，注射猪瘟活疫苗；第3组19头，注射高致病性蓝耳病灭活苗；第4组19头，同时分点注射O型口蹄疫和猪瘟疫苗，间隔7d后再注射高致病性蓝耳病疫苗；第5组19头，同时分点注射口蹄疫和高致病性蓝耳病疫苗，间隔7d后再注射猪瘟疫苗；第6组19头，同时分点注射高致病性蓝耳病和猪瘟疫苗，间隔7d后再注射口蹄疫疫苗；第7组20头，同时分点注射口蹄疫、猪瘟及高致病性蓝耳病疫苗。

1.7 免疫方法和部位 单种疫苗免疫，注射部位为左右颈部。2种疫苗和3种疫苗同时分点免疫，注射部位为左右颈部和腿部内侧。免疫有效剂量：口蹄疫疫苗1 mL、猪瘟疫苗1头份、高致病性猪蓝耳病灭活苗2mL。

1.8 临床不良反应观察 所有试验猪在免疫注射后临床观察7～10d，主要观察猪只精神状况是否良好，采食是否正常，体温有无升高，是否有其他严重不良反应，对异常的猪要作详细记录。

1.9 免疫抗体检测 免疫后的14、21、28、35 d和42 d经前腔静脉采血，分离血清。采用间接ELISA法进行猪瘟、O型口蹄疫、高致病性蓝耳病IgG抗体的间接ELISA测定，具体操作步骤依照试剂盒说明进行。

1.10 数据统计与分析 样品使用酶标仪于波长450 nm（630nm作为参比波长）下测定其吸光度（OD值），所得数据用SPSS10.0软件的One-Way ANVOA方法进行统计学分析。

1.11 田间试验 在以上3种疫苗同时分点免疫取得较好免疫效果和抗体合格率达标的情况下，随后在大竹县清河、永胜、欧家、李家、高穴等5个乡镇的多个散户或者猪场进行田间试验，并且在一免、二免、三免后用抗体快速金标检测卡检测其抗体合格率。

2 结果与分析

2.1 免疫副反应 对试验猪免疫后96 h内的精神、采食、体温变化等免疫副反应情况进行逐头观察和记录。试验组1～6组（单免对照组及两种疫苗联合免疫组）免疫猪113头，除第3组死亡1头外，未出现精神不振、食欲下降、体温升高等免疫副反应情况，未出现死亡情况。试验7组免疫猪20头，有1头出现呼吸急促、精神不振、食欲下降、体温偏高等一般免疫副反应，免疫副反应率为5%。

2.2 不同免疫程序口蹄疫抗体的产生情况 从表1和图1可看出，各组抗体水平都在35d达到了最高值，且维持时间较长，在42d的时候还处于比较高的抗体水平。第5、7组抗体水平要稍高于其他组（P＜0.05），口蹄疫和蓝耳病结合分点注射，其中包括3种疫苗联合，对口蹄疫抗体水平的提高起到了促进作用。而其他组合对口蹄疫的抗体效价没有较大的影响，和对照组单免口蹄疫的抗体水平保持一致。

表1 免疫猪口蹄疫血清IgG抗体间接ELISA检测（xˉ±s）

图1 免疫猪口蹄疫血清IgG抗体效价变化图

2.3 不同免疫程序高致病性蓝耳病抗体的产生情况

从表2和图2可以看出，高致病性蓝耳病抗体在免疫后35d达到较高的抗体水平，但是和猪瘟、口蹄疫抗体的OD值相比仍较低。第5组的抗体水平要高于其他组（P＜0.05），比单独注射蓝耳病疫苗的阳性率高，说明蓝耳病疫苗及猪口蹄疫疫苗分点同时注射对蓝耳病疫苗有效抗体的产生有积极的协同作用，并促进蓝耳病抗体的产生。第6组的抗体水平明显低于其他组（P＜0.05），说明猪瘟疫苗和高致病性蓝耳病疫苗同时分点注射对蓝耳病抗体的产生有一定的干扰作用。

表2 免疫猪蓝耳病血清IgG抗体间接ELISA检测（xˉ±s）

图2 免疫猪蓝耳病血清IgG抗体效价变化图

2.4 不同免疫程序猪瘟抗体的产生情况 从表3和图3可以看出，猪瘟抗体在免疫后的28d达到最高抗体水平，之后开始下降。第4、5组抗体水平和第2组对照组没有明显的差别（P＞0.05），说明猪瘟和口蹄疫联合分点注射没有互相干扰。第6、7组抗体水平较低，使猪瘟免疫抗体水平最高值推迟到接种后35d，说明蓝耳病疫苗及猪瘟疫苗分点同时注射对猪瘟有效抗体的产生有干扰作用，并推迟猪瘟免疫抗体水平的升高。

2.5 不同免疫程序在免疫后35d的抗体合格率 采用ELISA方法，具体操作参照试剂盒说明书进行。判定标准：待检血清450 nm（630 nm作参比波长）处的吸光值（OD值）大于阴性对照A值平均值的2.1倍，即判为阳性；如阴性对照孔OD值的平均值低于0.08时，则按照0.08计算。

表3 免疫猪猪瘟IgG抗体间接ELISA检测（xˉ±s）

图3 不同免疫程序猪瘟抗体变化图

从各组的合格率结果分析（见表4），每组的合格率达到了国家规定的标准，猪瘟和口蹄疫都达到了较高的合格率，相比之下高致病性蓝耳病抗体的合格率较低。从合格率看，第7组3种疫苗同时分点免疫达到了国家规定的标准，并且和单独免疫及分两次免疫相比，合格率没有很大的差异。

表4 免疫后35d不同抗体的合格率

2.6 3种疫苗同时分点免疫（田间试验）的抗体合格率及免疫副反应情况 田间试验的试验猪共592头，全都按照3种疫苗同时分点注射的方式进行。其中有3头出现了免疫副反应。在免疫后用抗体快速金标检测卡进行检测，其中对107头进行首免后30d检测；对102头进行二免后30d检测；对383头进行三免后30d检测。检测方法按照说明书进行，用肉眼观察检测线和对照线的差别。检测线颜色越深，抗体滴度越高，如果检测线颜色很浅，比对照卡中1∶16颜色都还浅的时候说明抗体滴度不合格。

从图4可以看出，首次免疫的检测线颜色较浅，二免和三免的检测线颜色逐步加深，说明抗体滴度随着免疫次数的增多而增强。从表5可以看出，抗体合格率都达到了国家规定的标准，猪瘟和口蹄疫呈高位态势。

3 讨论

3.1 猪瘟活疫苗和高致病性蓝耳病活疫苗的应用 本次研究，猪瘟活疫苗采用了1头份剂量对仔猪进行了免疫，从结果可以看出，不同方式的免疫接种，其平均猪瘟抗体OD值均在28～35d达到合格水平。而当前在大竹县实际生产中，不少散户自行进行多头份免疫，这种做法在实际生产中必要性不大。目前国内不少学者均持有相同观点。7个组高致病性蓝耳病的抗体水平都低于猪瘟和口蹄疫的抗体水平，说明高致病性蓝耳病活疫苗免疫一次的效果不是很好，必须要经过加强免疫才能达到较高的抗体水平。这与冉智光等得出的结论相似。

图4 3种疫苗联合分点免疫（田间试验）不同免疫次数的金标检测卡所显示的抗体滴度

表5 3种疫苗联合分点免疫（田间试验）的抗体合格率

3.2 两种疫苗同时分点免疫 猪瘟和蓝耳病疫苗同时分点免疫时，猪瘟抗体效价的产生出现了抑制和推迟，而在同时分点免疫的7d后又免疫口蹄疫苗，结果口蹄疫抗体值相对其他方式有所降低，高致病性蓝耳病的抗体水平也受到了影响，华树明、罗冬生等也得出了相同的研究结论，故这种免疫组合方式在实际生产中应尽量规避。同时分点免疫口蹄疫和蓝耳病，结果蓝耳病和口蹄疫的抗体值相对其他组增高，证明该两种疫苗在进行同时分点免疫时，具有明显的协同促进效应，这与当前多家类似研究的结果一致。在7d后免疫猪瘟，其抗体值和产生时间均不受影响。因此，根据本次试验的研究结果，大竹县猪场可采用第5组免疫方案。

3.3 3种疫苗同时分点免疫 3种疫苗同时分点免疫在实际生产中具有节省人工，降低生物安全风险，减少多次免疫所产生的应激等优势。本研究将猪瘟、猪口蹄疫、猪高致病性蓝耳病3种疫苗同时分点免疫时，表现出5%的免疫副反应。这与马睿麟等的研究结果存在差异，可能与本次试验对象的个体差异及群体数目相对较小有关。田间试验的试验猪共592头，有3头出现了免疫副反应，表现出0.5%的免疫副反应，但还在免疫反应的正常范围内（2%～0.05%）。总的说来，3种疫苗同时分点免疫的免疫副反应和单独免疫及两两结合免疫的免疫副反应没有明显的差别。

3.4 免疫次数和抗体效价的关系 从田间试验3种疫苗同时分点免疫各次免疫的抗体效价测定结果看，免疫次数和抗体效价成正比关系，加强免疫的抗体滴度明显高于首免的抗体滴度，所以通过加强免疫可以提高抗体的滴度，提高免疫保护力。

4 结论

通过猪场试验和田间试验对抗体滴度的测定以及抗体合格率的统计表明，3种疫苗同时分点免疫的抗体滴度维持在较高水平，抗体合格率都达到了国家规定的标准，所以在保证安全性和提高免疫效果的前提下，为节省人力、财力，以及减少多次免疫引发的猪应激反应，特别是在散养户和小型养猪场，可以推广3种疫苗同时分点注射的免疫方式，以此办法进行试点推广，推广结果有待我中心进一步作跟踪研究。

致谢：本试验得到了大竹县畜牧食品局的大力支持和大竹县动物疫病预防控制中心所有同志们的大力协助；另外，也得到了大竹县动物卫生监督所陈明、赵朝霞、李永川、王博等的大力帮助，在此一并致谢！

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