响应面法优化一株中度嗜盐菌的培养条件

2013-12-08陈蔚青李一飞申屠超

食品工业科技 2013年1期

陈蔚青，李一飞，申屠超

(浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州310015)

嗜盐菌(Halophiles)是存在于海洋、盐湖、盐场以及腌制品等高盐环境中的微生物，其种类繁多，分布的范围也较广。根据其对盐的嗜耐程度一般可分为弱嗜盐菌、中度嗜盐菌和极端嗜盐菌。嗜盐菌具有特殊的细胞结构、生理功能和代谢特性，大多数嗜盐菌能通过迅速合成和降解糖、氨基酸等小分子溶质，构成渗透压调节剂，帮助细胞从所处高盐环境中获取水分，并且稳定和保护菌体内酶的活性［1］。嗜盐菌具有极端水解酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等分泌能力，因而其在食品工业、饲料业、生物及化学工业等领域有重要应用前景，有望解决已有的水解酶在高盐环境下往往达不到最大活性的难题［2-4］。响应面优化设计法(response surface methodology，RSM)是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，可用来对受多个变量影响的响应问题进行数学与统计分析，并可以将该响应进行优化。近年来采用RSM对微生物培养条件进行优化已有一些报道，并取得了较好的优化结果［5-6］。本文拟利用RSM优化一株自行筛选的中度嗜盐菌sdc-3的培养条件，采用Plackett-Burman(P-B)设计法确定菌株生长的主要影响因子，用最陡爬坡路径逼近最大响应区域，然后利用中心组合实验设计(Central composite design，CCD)及响应面分析法进行回归，以期获得嗜盐菌sdc-3优化的培养条件，从而为后续应用研究提供技术数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

嗜盐菌甘油保藏菌株sdc-3 浙江树人大学生物工程实验室保藏，该菌株从腌肉表面分离，属中度嗜盐菌;经16S rDNA测序与序列比对，发现其与多株芽孢杆菌属(Bacillus)和海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)菌株序列同源性为93%，具体分类尚待进一步鉴定［7］;研究发现其具有较高的羧甲基纤维素酶活性。

表1 Plackett-Burman实验因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment design

培养基 LB 培养基［8］、高氏一号培养基［9］、CZ培养基［10］、牛肉膏蛋白胨培养基［11］、Gibbons 培养基［12］、酪蛋白培养基［13］;NaCl 视需要添加。

YS-100双目显微镜日本Nikon公司;Vis-7220可见分光光度计北京瑞利分析仪器公司;SHP-250生化培养箱上海森信实验仪器有限公司;SKY-2102c恒温振荡培养箱上海苏坤实业有限公司;移液枪Eppendorf Research;FD-2电加热器嘉兴市欣欣仪器设备有限公司;HG-50高压灭菌锅 HIRAYAMA制造公司;FA2104电子天平上海舜宇恒平科学仪器有限公司;SW-CJ-1FB超净工作台苏州净化设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同培养基对嗜盐菌培养情况的比较配制添加4%NaCl的6种培养基(LB培养基、高氏一号培养基、CZ培养基、Gibbons培养基、酪蛋白培养基和牛肉膏蛋白胨培养基)，灭菌后按每个250mL摇瓶中100mL的装液量加入，以2%接种量分别接入菌种，在35℃、p H7.5、120r/min条件下培养52h，期间定期测定培养液的OD600nm净增值，绘制生长曲线，比较不同培养基中嗜盐菌生长情况，选择生长情况较好的一个培养基进行后续实验。

1.2.2 耐盐性实验按1.2.1实验确定培养基后，分别配制不同盐度的培养基，即:0%、2%、4%、5%、6%、8%、10%、12%，按每个250mL摇瓶中100mL的装液量加入，以2%接种量加入菌种，在35℃、pH7.5、120r/min条件下培养2d，测OD600nm的净增值，比较嗜盐菌在不同盐度下的生长情况，选择最佳生长盐度。同时采用菌落计数法检测不同盐度下菌体的存活率。

1.2.3 响应面优化实验

1.2.3.1 Plackett-Burman设计法筛选嗜盐菌培养重要影响因素根据实验室前期实验研究结果并参考相关文献［14-16］，本实验选取6个因素作为研究对象(表1)，另外选择3个虚拟项以考察误差。每个因素均选取高、低两个水平，运用design expert 7.0设计软件设计出P-B实验组次为12组，以600nm时的吸光度净增值为响应值，运用design expert 7.0对实验结果进行分析，观察方差分析中的显著性和拟合度，比较各因素对嗜盐菌生长的影响。

1.2.3.2 最陡爬坡实验 P-B实验找出三个显著影响因素后，为使响应面能更好地反映真实情况，进行最陡爬坡实验逼近最佳响应区域。以P-B实验为基础，根据分析得到的一次回归模型方程及显著因素的效应值判断最陡爬坡实验的走向和步长，设计实验方案，进行最陡爬坡实验。选取600nm时吸光度净增值最大的组合。

1.2.3.3 中心组合(CCD)实验依据最陡爬坡实验得出的嗜盐菌最佳生长区域后，运用design expert 7.0设计软件设计中心组合实验的组合表，以600nm时的吸光度净增值为响应值，中心点组合重复5次，共17次实验。将所得吸光度净增值填入相应组次，应用软件进行分析，观察方差分析中的显著性及拟合度，并将结果建立三维响应曲面，观察中心点是否突出，最后可由软件计算得出嗜盐菌的最佳培养条件。

1.2.3.4 验证实验按照软件处理后所得的最佳培养条件配制培养基和设定培养条件，在此基础上设置三个平行实验，取平均值，比较所测得的OD600nm净增值是否与预测值相近，若相近，则本次响应面优化实验成功，所得条件可信。

2 结果与讨论

2.1 培养基的选择

由图1可见，该嗜盐菌在不同培养基中生长情况差异较大，在LB培养基和酪蛋白培养基中生长状况相对较好。酪蛋白培养基是嗜盐菌培养常用培养基，但由于酪蛋白几乎不溶于水，配制酪蛋白培养基时需先将酪蛋白溶于稀碱液并加热方能溶解，且该培养基易产生沉淀，故为方便操作、减小后续实验中生物量测定时的误差，实验选择LB培养基作为基础培养基。根据图1生长曲线形态，培养时间可确定为48h。

图1 sdc-3菌株在不同培养基中的生长情况Fig.1 Growth condition of strain sdc-3 in different media

2.2 耐盐性实验结果

由耐盐性实验结果可见，sdc-3菌种在0%～10%盐度区间内生长较好，超过10%盐度有明显下降趋势。在0%和2%盐度情况下该菌株生长状况与5%～6%盐度下几乎无异，推测因为该菌株是从腌制品中筛选获得，腌制品在腌制过程中是逐步失水，可能导致该菌种盐度适应范围较广。文献中［17-20］对中度嗜盐菌的定义大致为“中度嗜盐菌是一类能够耐受0%～32%高盐环境，在3%～15%最佳生长的极端微生物类群”，与本实验结果基本一致。结合中度嗜盐菌特性及本实验的结果，后续实验选择盐度5%～6%为条件优化的基础。本实验同时采用菌落计数法检测了不同盐度下菌体的存活率，结果表明在0～10%盐度下sdc-3菌株的菌体存活率在98%以上，不同盐度间存活率无显著性差异。

表2 Plackett-Burman实验方案与结果Table 2 Design and result of Plackett-Burman experiment

图2 sdc-3菌株在不同盐度下的培养情况比较Fig.2 Comparison of growth condition of strain sdc-3 in different salinity

2.3 响应面优化设计结果

2.3.1 Plackett-Burman实验结果 P-B实验结果见表2，因素影响效果分析见表3。在95%置信区间下，C(盐度)、D(初始pH)和F(培养温度)为显著影响因子。同时得到一次回归模型方程:Y=1.21+0.074A+0.12B-0.39C+0.32D-0.14E+0.93 F，复相关系数R2=0.9809，拟合很好，6个因子对响应值的影响大小依次是:培养温度＞盐度＞初始pH＞装液量＞酵母提取物＞胰蛋白胨。相较于培养基成分，嗜盐菌对于温度等培养条件更为敏感，这可能与单因素实验已优化了培养基的基本组成有关。由上述一次回归模型方程可知，A(胰蛋白胨)、B(酵母提取物)、E(装液量)效应值较小，在95%的置信区间内对嗜盐菌生长没有显著影响。考虑到若偏回归系数为正值表明该因素起正效应，应取高水平;若系数为负值则表明该因素起负效应，取低水平，因而根据A、B、E 系数(0.074、0.12、-0.14)取胰蛋白胨 10g/L、酵母提取物5g/L、装液量70m L/250m L摇瓶。

表3 Plackett-Burman实验因素影响效果分析Table 3 Effects of Plackett-Burman experiment

2.3.2 最陡爬坡实验结果根据P-B实验结果可知，C(盐度)、D(初始pH)和F(培养温度)在95%的置信区间内对嗜盐菌生长具有显著影响。对C、D、F进行最陡爬坡，由表4可知，最优条件在第四项附近，因此以C(盐度)浓度5%、D(初始 pH)8.0、F(培养温度)33℃作为后续响应面实验的中心点。

表4 最陡爬坡实验设计和结果Table 4 Experimental design and results of steepest ascent

2.3.3 中心组合实验设计和结果根据最陡爬坡实验得到的中心点对盐度、初始pH和培养温度进行中心实验组合设计，为使拟合方程具有旋转性和通用性，中心点重复5次。自变量水平及编码见表5，实验设计及结果见表6。

通过design expert 7.0软件分析，各个因子的偏回归系数估计值及方差分析结果见表7。

由此表可得到拟合的全变量编码水平的二次回归方程为:Y=3.30+0.18C-0.058D-0.043F+0.057CD+(7.250E-003)CF-0.046DF-0.18C2-0.11D2-0.20F2。

表5 中心组合实验的变量和水平Table 5 Code-level and values of central composite design

表6 中心组合实验设计及实验结果Table 6 The central composite design and the result

表7 中心组合实验的方差分析Table 7 The regression analysis of the central composite design experiment

由表7可知，模型(p值为＜0.0001)是非常显著的，模型失拟项(Lack of Fit)表示模型预测值与实际值不拟合的概率，而失拟项p值为0.1188，大于0.05，模型失拟项不显著，模型选择合适。回归系数R2=0.9902＞0.9，说明模型相关度很好。可以使用该模型来分析响应值的变化。

2.3.4 响应面分析为了进一步研究相关变量间的交换作用以及确定最优点，通过design expert 7.0软件绘制响应面曲线图进行可视化分析，3组以菌体增长量(OD600nm净增值)为响应值的趋势图见图3～图5。由图可知，响应值存在最大值，经软件分析计算，得到嗜盐菌培养生物量预测值最大时的组分浓度及培养工艺条件:盐度为5.48%，初始pH为7.94，培养温度为32.83℃，预测值OD600nm净增值为3.352。

从图像上也可看出，中心红的区域越趋近于中心，区域俯视图形越趋近于椭圆形，则表明两变量间交互作用越显著，越近于圆形则相反。

图3 盐度与初始pH交互作用曲面图Fig.3 Response surface of interaction for salinity and initial pH

图4 盐度与培养温度交互作用曲面图Fig.4 Response surface of interaction for salinity and culture temperature

图5 初始pH与培养温度交互作用曲面图Fig.5 Response surface of interaction for initial pH and culture temperature

2.3.5 验证实验为检验响应面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行验证实验。考虑到实际操作的便利，将部分优化参数修正为pH7.9、培养温度32.8℃，其余条件不变。经3次重复实验，测得菌体增长量(OD600nm净增值)为3.349±0.021，与理论预测值3.352非常接近，表明该模型是合理有效的，能很好地预测实际的菌体生长情况。

3 结论

本项目研究了一株筛选自腌肉制品表面中度嗜盐菌的优化培养条件。单因素实验确定LB为基础培养基，并确定合适盐度区间基础上，采用Plackett-Burman设计对影响嗜盐菌生长的重要培养基成分和工艺条件进行筛选，确定主要影响因子为盐度、初始pH和培养温度;再用最陡爬坡实验逼近最大响应区域;最后用中心组合设计和响应面分析法，确定了主要影响因子的取值。优化后的培养基组成为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 54.8g/L;培养工艺条件为初始 p H7.9、培养温度 32.8℃、装液量70mL/250mL摇瓶、摇床转速120r/min。在此培养条件下培养2d后，嗜盐菌的密度(OD600nm净增值)达3.349±0.021，较优化前提高了13%。且与预测值拟合良好，说明有实际指导作用。

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