GDL诱导大豆分离蛋白冷凝胶对益生菌的保护

张英华，田柬昕，刘德库

(东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030)

益生菌参与机体某些重要代谢反应［1］，能改善人体肠道功能，提高机体免疫力，预防某些疾病的发生［2］，但是由于其生长环境的特定性，使得益生菌的应用受到局限或达不到预期效果。在胃酸环境下，益生菌会大量死亡无法到达肠道定植发挥有益作用。凝胶性是蛋白质形成交替立体网状结构的性能。大豆蛋白分散于水中形成溶胶体，这种溶胶体在一定条件下可转变为凝胶。大豆蛋白凝胶化是一个复杂的过程［3］，一般包括蛋白质分子链的展开、分裂、结合及聚集等几个历程，蛋白质是通过充分伸展的肽键之间的相互交联而形成凝胶的，大豆蛋白在受热的情况下，球状的蛋白质分子开始伸展开来，原来包埋在卷曲的分子链内部的功能基团，如二硫基、疏水基团暴露出来。为减少体系的能量，相邻的分子通过二硫键、氢键、疏水作用、静电引力以及范德华力交联形成具有网络状三维空间结构，将水和其他成分包埋起来，形成凝胶。许多研究人员利用大豆蛋白凝胶对叶酸、生物活性肽进行了保护［4-6］。近期，有研究人员对盐诱导的大豆分离蛋白凝胶对益生菌的保护进行讨论［7］，得出大豆分离蛋白凝胶所具有的三维网状结构可以将益生菌包埋起来对其进行保护。本文利用GDL这种常见的添加剂作为大豆分离蛋白的诱导剂，将所得到的凝胶应用到益生菌保护中，这不仅为益生菌产品更好应用提供了好方法，同时也为大豆分离蛋白的利用开辟出新出路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1株瑞士乳杆菌 东北农业大学KLDS乳品工业微生物菌种保藏中心(KLDS-DICC);大豆分离蛋白(SPI) 哈高科大豆食品有限公司(蛋白质含量90.40%);葡萄糖酸内酯(GDL) 天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

85-2数显恒温磁力搅拌器 金坛市双捷实验仪器厂;XK 96-A快速混匀器 姜堰市新康医疗器械有限公司;VD-1320洁净工作台 北京东联哈尔滨仪器制造有限公司;GL-20G-Ⅱ立式高速冷冻离心机 上海市离心机械研究所;HVE-50型高压灭菌器 日本HIRAYA-MA公司;手动移液器 德国Eppendorf股份公司;恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;Delta320型p H计 瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌体的培养和收集 菌种活化后，以2%的接种量接种到无菌MRS液体培养基中，37℃的恒温培养箱中培养12h。菌液在温度4℃，转速6000r/min，离心10min，将沉淀物即菌泥放入生理盐水中洗涤，用混匀器混匀后再次离心并洗涤两次。菌泥洗涤后悬浮在无菌生理盐水中，使得浓缩菌体浓度为109cfu/mL，备用。

1.2.2 平板菌落计数法 参考GB 4789.35-2010的方法，略有改动。

将样品稀释，选择2个或3个以上适宜稀释度注入到培养基中。每个稀释度做3个平行样。将接好菌的平板放置到37℃的恒温培养箱中培养48h，选取菌落数在30～300之间的平板进行计数，然后乘以稀倍数，得到每毫升菌液中的菌体数量。

1.2.3 包含乳酸菌的大豆蛋白冷凝胶的制备 称取一定质量的SPI充分溶解到一定量的无菌水中，在室温的条件下放置到磁力搅拌器上温和搅拌1h，使SPI充分的溶解。搅拌完成，放入到一定温度水浴锅中加热30min后，SPI变性，迅速放入到冷水浴中冷却到室温，并保持2h，使SPI变性后的结构得到保持。加入一定浓度的GDL和备用的菌液，磁力搅拌器温和搅拌形成凝胶，4℃下放置一夜，备用。

1.2.4 大豆蛋白冷凝胶体系中乳酸菌酸耐受性评价

移液器移取2mL冷凝胶，溶于18mL p H1.2酸性溶液中，并放置在37℃恒温培养箱中作用30min，分别在0、15、30min取样并进行菌落计数，计算在不同时间下的乳酸菌的存活率。每个实验重复3次，取平均值。

1.2.5 不同变性温度对凝胶体系中乳酸菌酸耐受性的影响 变性温度分别为 75、80、85、90、95℃，按照1.2.3中方法制备大豆分离蛋白凝胶体系，其中SPI溶液的终浓度为8%，GDL的终浓度为1.2%，按照1.2.4进行耐受性评价。

在确定最优温度后，以浓度8%的未变性SPI溶液作为对照，同样进行耐受性评价。

1.2.6 不同SPI浓度对凝胶体系中乳酸菌酸耐受性的影响 SPI溶液的终浓度分别为7%、8%、9%、10%、11%，按照1.2.3中方法制备大豆分离蛋白凝胶体系，GDL的终浓度为1.2%，变性温度采用1.2.5中最优的值。按照1.2.4方法进行耐受性评价。

在确定最优SPI浓度后，用最优浓度下为未变性的SPI溶液作为对照，同样进行耐受性评价。

1.2.7 不同GDL浓度对凝胶体系中乳酸菌酸耐受性的影响 GDL的终浓度分别为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%，按照1.2.3中方法制备大豆分离蛋白凝胶体系，其中SPI溶液的终浓度分别为1.2.6中最优值，变性温度采用1.2.7中最优值。按照1.2.4方法进行耐受性评价。

在确定最优GDL浓度后，以1.2.6中最优值终浓度的SPI溶液作为对照，其变性温度为1.2.5中的最优值，不加入GDL，同样进行耐受性评价。

1.2.8 正交实验设计 分别采用各单因素中的最优值及左右的2个值进行正交设计，所用的正交表为三因素三水平正交表。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Experimental factors of orthogonal experiment analysis

1.3 数据处理

实验所得数据利用Excel2003和SPSS16.0数据分析软件进行处理和分析。

2 结果与讨论

2.1 不同变性温度对凝胶体系耐受性的影响

浓度为8%的 SPI溶液，分别经过 75、80、85、90、95℃这5种不同温度变性后，在浓度为1.2%GDL的诱导下成胶，形成含有乳酸菌的大豆分离蛋白冷凝胶。p H1.2酸性条件下，37℃恒温培养箱中培养30min，分别在0、15、30min取样并进行菌落计数，所得到的菌落数的变化如图1所示。

图1 不同变性温度形成冷凝胶在酸性条件下对菌体的保护作用Fig.1 Protection on bacteria by SPI based cold-set gels formed under different temperature

由图1可知，包含乳酸菌的大豆分离蛋白凝胶在酸性条件下作用15min后，5个实验组之间的菌落数差异不显著(p＞0.05)，5个实验组与其对照之间的菌落数差异也不显著(p＞0.05)。随着作用时间的延长，在作用30min后，各实验组之间的菌落数差异仍然不显著(p＞0.05)，这就表示在不同温度下形成的冷凝胶对菌体的保护作用无显著差异;但通过比较实验组与对照组的菌落数发现，5个实验组与对照之间的菌落数差异显著(p＜0.05)，表明冷凝胶对菌体有明显的保护作用。GDL诱导形成的大豆分离蛋白冷凝胶在酸性条件下作用30min后，变性温度为85℃的样品乳酸菌的存活率最高，比对照组提高了181～254倍，菌落数(cfu/mL)由107降为105，仅仅下降了2个数量级，而对照组却下降了5个数量级。

2.2 不同SPI浓度对乳酸菌凝胶体系耐受性的影响

用85℃作为 SPI变性温度，分别对7%、8%、9%、10%、11%这5个不同浓度的SPI进行加热变性，以浓度为1.2%GDL诱导形成含有乳酸菌的大豆分离蛋白冷凝胶。pH1.2酸性条件下，37℃恒温培养箱中培养30min，分别在0、15、30min取样并菌落计数，所得到的菌落数的变化如图2所示。

图2 不同SPI浓度形成冷凝胶在酸性条件下对菌体的保护作用Fig.2 Protection on bacteria by SPI based cold-set gels formed by different concentration of SPI

由图2可知，包含乳酸菌的大豆分离蛋白凝胶在酸性条件下作用15min后，5个实验组之间的菌落数差异不显著(p＞0.05)，5个实验组与对照之间的菌落数差异也不显著(p＞0.05)。随着作用时间的延长，在作用30min后，各实验组之间的菌落数差异仍然不显著(p＞0.05)，这就表示在不同质量浓度SPI条件下形成的冷凝胶对菌体的保护作用无显著差异;但5个实验组与对照之间的菌落数差异显著(p＜0.05)，表明冷凝胶对菌体有明显的保护作用。GDL诱导形成的大豆分离蛋白冷凝胶在酸性条件下作用30min后，SPI浓度为8%的样品乳酸菌的存活率最高，存活率比对照组提高了359～380倍，菌落数(cfu/mL)由107降为105，仅仅下降了2个数量级，而对照组却由107降为102，下降了5个数量级。

2.3 不同GDL浓度对乳酸菌凝胶体系耐受性的影响

用85℃作为变性温度，SPI质量浓度为8%，GDL浓度分别为0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%诱导形成含有乳酸菌的大豆分离蛋白冷凝胶。pH1.2酸性条件下，37℃恒温培养箱中培养30min，分别在0、15、30min取样并菌落计数，所得到的菌落数的变化如图3所示。

由图3可知，包含乳酸菌的大豆分离蛋白凝胶在酸性条件下作用15min后，5个实验组之间的菌落数差异也不显著(p＞0.05)，5个实验组与对照之间的菌落数差异也不显著(p＞0.05)。随着作用时间的延长，在作用30min后，各实验组之间的菌落数差异仍然不显著(p＞0.05)，这就表示在不同浓度SPI条件下形成的冷凝胶对菌体的保护作用无显著差异，但5个实验组与对照之间的菌落数差异显著(p＜0.05)，表明冷凝胶对菌体有明显的保护作用。GDL诱导形成的大豆分离蛋白冷凝胶在酸性条件下作用30min后，GDL浓度为1.2%的样品乳酸菌的存活率最高，存活率比对照组提高了209～234倍，菌落数(cfu/mL)由107降为105，仅仅下降了2个数量级，而对照组却由107降为102cfu/mL，下降了5个数量级。

图3 不同GDL浓度形成冷凝胶在酸性条件下对菌体的保护作用Fig.3 Protection on bacteria by SPI based cold-set gels formed by different induced agent

2.4 正交实验结果

单因素实验中，样品在未经酸处理前取样并菌落计数的数值基本相同，其处理后的菌落计数数值即可反映乳酸菌的存活率。正交实验中，以存活率为指标，根据以上3个单因素，所得正交实验结果见表2。

表2 正交实验结果表Table 2 The result of orthogonal design

由表1可知，3个因素的极差大小是C＞B＞A，表明:GDL浓度对实验结果影响最大，其次是SPI浓度，对实验结果影响最小的因素是温度。对正交实验的结果进行分析得到本实验的最优方案为:A3B3C2，即大豆分离蛋白冷凝胶的成胶条件为变性温度90℃、SPI浓度9%、GDL浓度1.2%时，活菌落的数量级(cfu/mL)由初始的107变为105，仅下降2个数量级，存活率为26.61%，对乳酸菌的保护效果最佳。

3 结论

研究表明，变性温度90℃、SPI浓度9%以及GDL浓度1.2%时，乳酸菌的存活率最高为26.61%。验证实验表明，活菌落的数量级(cfu/mL)由初始的107变为105，仅下降2个数量级;而对照组的活菌落数量级下降5个，这表明其乳酸菌存活率明显高于对照组。说明大豆分离蛋白凝胶对益生菌有一定的保护作用，并通过耐受性实验得到GDL诱导大豆分离蛋白冷凝胶保护益生菌最优的凝胶条件。这对益生菌的保护和大豆分离蛋白的利用提供了一些参考。

［1］张民 .益生菌的营养和免疫［J］.饲料研究，2002，10:6-8.

［2］刘晗璐，李光玉，孙伟丽.益生菌益生特性的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2010，37(2):166-169.

［3］Ana Paula Batista，Carla A M Portugal，Isabel Sousa，et al.Accessing gelling ability of vegetable proteins using rheological and fluorescence techniques［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2005，36:135-143.

［4］Lingyun Chen，Gabriel E Remondetto，Muriel Subirade.Food protein-based materials as nutraceutical delivery systems［J］.Trends in Food Science and Technology，2006，17:272-283.

［5］Anne Maltais，Gabriel E Remondetto，Muriel Subirade.Soy protein cold-set hydrogels as controlled delivery devices for nutraceutical compounds［J］.Food Hydrocolloids，2009，23:1647-1653.

［6］Anne Maltais，Gabriel E Remondetto，Muriel Subirade.Tabletted soy protein cold-set hydrogels as carriers of nutraceutical substances［J］.Food Hydrocolloids，2010，24:518-524.

［7］张英华，刘德库.盐诱导大豆蛋白冷凝胶对乳酸菌的抗酸保护作用［J］.食品发酵与工业，2011，37(1):47-51.