补肾方对胎鼠骨骼肌肌酸激酶活性的影响

许凯霞，王永辉，杨向竹，冯前进

（1.山西中医学院，山西 太原030024； 2.北京中医药大学，北京100029）

目前，对健康和疾病发育起源（DoHaD）的研究正成为全球范围内的重大挑战之一［1］。大量临床流行病学研究及动物实验证明胎儿在宫内发育时受到遗传因素和宫内环境的影响，不仅会影响胎儿期的生长发育，并可能产生持续的结构功能改变，导致将来一系列成年期疾病的发生［2-5］。其中，胎儿对多种宫内不良环境的一个常见反应是引起胎儿宫内发育迟缓（IUGR）。

胎儿宫内发育迟缓（IUGR），是指胎儿出生体重低于同胎龄平均体重的第十个百分位或两个标准差，与成年期糖尿病、高血压等多种慢性重大疾病的发生密切相关［6-7］，类似于中医的“胎萎不长”。祖国的传统中医药本着“肾为先天之本，肾主生殖发育”和“补母益子”的理论，有着治疗“胎萎不长”的丰富经验。本研究结合目前国内外围产医学、计划生育科学及对健康和疾病发展起源的研究十分关注的慢性非传染性成人疾病的“胎儿起源”学说，选用酒精给妊娠小鼠灌胃致IUGR模型，选择动物体内能量代谢必不可少的肌酸激酶（CK）为观察指标，采用古今治疗肾虚的补肾名方给孕鼠灌胃，同时与补气、补血等方做比较，以探讨补肾方对胚胎能量代谢的影响，从现代医学角度为中医的“肾为先天之本，肾主生殖发育”和“补母益子”理论提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 远交系昆明种小鼠，体重（28±2）g，购于中国医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK（京）0089326，2004-0001。

1.1.2 药物与试剂 左归丸（熟地∶山药∶山萸肉∶枸杞子∶菟丝子∶鹿角胶∶龟板胶∶川牛膝=8∶4∶4∶4∶4∶4∶4∶3），右归丸（熟地∶山药∶山萸肉∶枸杞子∶菟丝子∶鹿角胶∶杜仲∶当归∶肉桂∶制附子=8∶4∶3∶4∶4∶4∶4∶3∶2∶2），五子衍宗丸（枸杞子∶炒菟丝子∶覆盆子∶盐炒车前子∶蒸五味子=8∶8∶4∶2∶1），四君子汤（党参∶炒白术∶茯苓∶炙甘草=2∶2∶2∶1）。原药材均来自山西省中医药研究院草药房，每方质量浓度均为生药量1 g/mL。药物的煎制和浓缩均用陶瓷制品手工操作。分析纯乙醇（广州化学试剂二厂，批号：2007061201）加蒸馏水配制成40%（V/V）的乙醇溶液，临用现配。肌酸，三羟甲基氨基甲烷，ATP，半胱氨酸，三氯醋酸，氨基萘酚磺酸，磷标准溶液等。

1.1.3 主要实验仪器 BECKMAN低温高速离心机，岛津UV-3000紫外可见分光光度计。

1.2 实验方法

1.2.1 分组 小鼠雌雄比例2∶1合笼过夜，次日晨检见阴栓者或阴道涂片镜检见精子者，确定为受孕，当日记为受孕0 d，将孕鼠随机分为正常对照组、IUGR模型组、左归丸组、右归丸组、五子衍宗丸组、四君子汤组、四物汤组、八珍汤组，共8组。

1.2.2 模型制备与给药方法 除正常对照组外，其余各组于受孕8 d用酒精灌胃，12 mL/kg，1次/d，至19 d杀检，共11 d。各治疗组在8 d造模同时，分别予左归丸、右归丸、五子衍宗丸、四君子汤、四物汤、八珍汤灌胃，30 mL/kg；IUGR模型组和正常对照组予生理盐水灌胃，30 mL/kg，1次/d。

1.2.3 样品制备与指标检测 19 d剖取胎仔，将胎仔左前肢肌肉除下，用0.25 M蔗糖溶液清洗，加3 mL蔗糖行组织匀浆（冰浴），静置提取1 h，离心抽提（3 000 rpm，15 min），保留上清液，沉淀加 2 mL蔗糖溶液，混匀2 min，静置提取1 h，再离心抽提（3 000 rpm，15 min），将2次的离心抽提液混合待测。由于CK 受许多金属离子如 Zn2+、Ca2+、Fe3+、Mn2+的抑制，还有柠檬酸、氟化物、尿素、过量ATP、EDTA等的抑制，所以在试剂配制过程及测定过程中极注意清洁、高纯，以免使CK失活。测定方法用无机磷酸法［8］，利用CK催化肌酸和ATP生产磷酸肌酸，与钼酸铵生成磷钼酸铵，后受氨基萘磺酸还原而成蓝色复合物。用岛津UV-3000紫外可见光分光光度计1 cm比色杯，650 nm处比色，查磷标准曲线，求得单位数。磷标准曲线是将不同浓度磷溶液代替所测酶溶液，其过程相同。

1.3 统计学方法

用SPSS16.0软件统计包对各组数据进行统计，数据以（s）表示，多组间采用单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

补肾及补益气血方剂对胎鼠骨骼肌肌酸激酶（CK）活性的影响，结果见表1。

表1 补肾及补益气血方剂对胎鼠CK活性的影响 （s）

表1 补肾及补益气血方剂对胎鼠CK活性的影响 （s）

注：与模型组比较，1）P<0.05，2）P<0.01

组别 给药剂量（mL/kg）n CK活性（U/mg）正常对照组 - 5 8.90±0.652）IUGR模型组 - 4 7.55±0.34五子衍宗丸组 30 5 7.49±0.92左归丸组 30 6 8.70±0.562）右归丸组 30 5 8.37±0.461）四物汤组 30 3 7.80±1.63四君子汤组 30 4 7.72±0.89八珍汤组 30 4 8.67±0.541）

从表1可看出，IUGR模型组胎鼠骨骼肌CK活性比正常对照组明显降低，补肾阴左归丸、补肾阳右归丸及气血双补八珍汤方剂对胎鼠降低的骨骼肌CK活性有明显恢复作用，尤以补肾阴方剂左归丸作用最明显。平补肾方五子衍宗丸和单纯的补气四君子汤、补血四物汤则无此作用。

3 讨论

能量是维持生物体新陈代谢、生长、发育的源泉，从糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢等至生物体的每一器官的运动，能量的储存与释放过程无处不在。那么，能量代谢如何在中医治则中体现呢？

3.1 胎儿代谢及运动的能量来源

能量供给在胎儿发育过程中是必不可少的，它负担着胎儿肌肉收缩等运动。而能量的最终来源究竟为何物？众所周知，从低等的单细胞生物到高等生物及人类，胎儿代谢及运动的能量的释放、储存和利用都是直接以ATP为线进行的。然而机体产生的ATP，并不是随时被利用，而是以一种特殊物质方式储存起来，当机体需要大量能量时，ATP便又被释放出来，磷酸肌酸（CP）就是这种储能的物质。肌肉收缩所需能量来自ATP的分解，但酵解抑制后，刺激肌肉收缩持续的时间为肌肉内ATP功能所维持的5倍，可见除ATP外还有其他高能物质提供能量，CP就是这种高能化合物。CP在肌肉中的浓度比ATP高5倍，在CK作用下可迅速将所含高能磷酸键转到ADP分子形成ATP，参与胎儿肌肉运动。

3.2 胎儿肌肉运动的能量与中医理论的联系

中医理论认为：肾藏精，主生殖和发育，其所藏之精包括先天之精和后天之精。其中，先天之精受之于父母，是胚胎形成的原始物质，对人体进一步生长发育及繁殖后代的能力有促进作用；后天之精是出生后，从吸入的自然界清气及摄入的饮食物中摄取的营养精华成分以及脏腑气化所生成的精微物质。肾精的构成，是以先天之精为基础，加之部分后天之精的充养而成。先天之精是肾精的主体成分，后天之精仅起充养作用，因而肾精所化的肾气，也主要属先天之气，即元气，元气是维持人体生命活动的基本物质与原动力，主要功能是推动人体的生长和发育，温煦和激发脏腑、经络等组织、器官的生理功能。又，精血可互生即“精血同源”。所以气血之源来源于肾，同时气、血、精又有相辅相成的作用。血之所以能循行脉中，周流不息，与气的功能极为密切，气行则血行，气滞则血滞，“气为血之帅”，“血为气之母”，气血亦可互生。

本研究显示，孕鼠投以补肾阳方右归丸、补肾阴方左归丸，对胎鼠骨骼肌CK活性均产生了明显增高作用，从现代医学的角度为中医“肾为先天之本，肾主生殖发育”和“补母益子”理论在能量代谢方面提供了依据。气血双补方剂八珍汤亦可增高胎鼠骨骼肌CK活性，可能是由于通过气血双补先充实了母体的后天之精，进而间接补充了胎鼠的先天之精。中医气血循环体系与现代医学人体全身代谢有极为相似之处。从受精卵、胚胎发育、幼儿期、少儿期、成人期至衰老死亡，人类体内代谢及遗传一直处于闭合循环体系中，三大营养物质糖类、脂类、蛋白质的生物合成与代谢及遗传信息的复制、转录和翻译都遵循循环体系，而许许多多更小的循环体系如TAC环、氮循环、鸟苷酸循环等又贯穿于人体大代谢中。中医补肾、气血双补方剂作用于人体代谢的循环中，对肌肉能量代谢的影响可能作用于两个方面，一是作用于整个能量代谢的过程，即从葡萄糖进入己糖激酶转化为6-PGLasose开始的每一步骤，中医方剂都参与其调控机能。二是直接作用于靶位点，即能量调节中心点，就是直接参与肌肉能量代谢关键酶CK、ATP 酶等的合成与激活作用［8］。

总之，中医方剂对人体的影响是一个比较复杂的过程，需经过许多现代科学，如分子生物学、分子遗传学、生物化学、基因工程等多学科研究、证实才能有一个确切结论。而我们只是通过一些分子酶学的研究，对中医理论有些新的认识，提出一些新的假设，还需不断深入研究讨论。

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［2］杨慧霞.健康与疾病的发育起源学说引发的思考［J］.中华围产医学杂志，2008，11（3）：157.

［3］李世刚，茅彩萍，徐智策.健康与疾病的发育起源研究进展［J］.中华围产医学杂志，2010，13（6）：463.

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［5］曾婵娟，杨慧霞.健康和疾病的发育起源研究现状［J］.国际妇产科学杂志，2011，38（1）：3.

［6］Godfrey K M，Barker D J.Fetal nutrition and adult disease［J］.Am J Clin Nutr，2000，71（5 Suppl）：1 344.

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