花椒籽中黑色素提取工艺的优化研究

徐文秀，王晓燕，王 鹏

(运城学院生命科学系，山西运城044000)

花椒(ZanthoxylumL bungeanum Maxim)别名又叫香椒、大花青椒、山椒，属被子植物门(Magnoliophydta)双子叶植物纲(Magnoliopsida)，无患子目(Sapindales)芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum)山花椒种(Zanthoxylum schinifolium)。花椒在我国有非常悠久的栽培历史，是我国传统的“八大调味料”之一。花椒在我国主要产区为陕西(韩城)、四川、重庆、山东、山西、河南、河北等地［1］。据报道，2009年全国花椒栽培面积已达133.3万hm2，年产花椒100万t，花椒籽作为主要副产物，理论上比果皮超出20%左右，因此花椒籽年产约60万t［2］。山西运城巿有很多丘陵地区，这些地区很适合花椒种植。每年大量花椒上巿后，作为副产物的花椒籽，却长期以来未被充分利用。大量的花椒籽被廉价收购，或当作燃料烧掉或撒入田中作为肥料，甚至被当作废物丢弃，造成极大的资源浪费。如何利用花椒籽这一资源已迫在眉睫。综合开发利用花椒籽既可以解决资源浪费、环境污染的问题，还可以带动大批的当地椒农致富。因此，加快花椒籽的研究开发具有现实和长远意义。研究结果［3］表明:花椒籽的种皮富含天然黑色素。近年来的研究发现，天然黑色素具有抗癌、抑制艾滋病毒复制、抗蛇毒、治疗帕金森症等功能［4］。因此，黑色素在化妆品、食品、医药等领域有着非常广泛的应用前景。目前，已从黑木耳［5］、黑芝麻［6］、桂花种子皮［7］、黑糯米［8］等天然黑色素食品中提取出黑色素，但有关花椒籽中黑色素提取和开发利用的研究报道还很少。因此，本实验研究花椒籽中黑色素提取工艺，为花椒籽黑色素的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花椒籽 产自山西运城夏县;氢氧化钠、浓盐酸、无水乙醇 均为分析纯。

AF1104型电子天平 上海越平科学仪器有限公司;101A-1E型电热恒温鼓风干燥箱 上海实验仪器总厂;752N紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;SHZ-D(III)型循环水多用真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验工艺流程

原料→预处理→按比例加入提取剂→水浴浸提→过滤→定容→比色

1.3 实验设计

首先确定提取花椒籽黑色素最佳提取溶剂、提取液最大吸收波长。然后通过单因素实验研究提取液浓度、提取温度、提取时间、料液比及提取次数对黑色素提取效果的影响。在单因素实验的基础上选取对花椒籽黑色素得率影响明显的因素:A提取温度(℃)、B提取时间(min)、C料液比(g/m L)，根据Box-Behnken中心设计原理，采用Design Expert软件程序设计3因素3水平的中心组合实验。因素水平见表1。

表1 旋转二次正交因素与水平Table 1 Analytical factors and levels for RSA

2 结果与分析

2.1 最佳提取溶剂的确定

在提取温度 20℃、提取时间 48h、料液比1∶10(g/m L)、提取次数1次的条件下，用不同的提取溶剂对花椒籽黑色素进行提取。提取结果如表2所示。确定0.1mol/L NaOH溶液为提取花椒籽黑色素的溶剂。

表2 提取溶剂对黑色素得率的影响Table 2 Effect of extraction solvent on extraction ofmelanin

2.2 最大吸收波长确定

在料液比1∶10(g/m L)、提取温度20℃、提取时间4.5h、提取次数1次的条件下，研究提取溶剂NaOH溶液浓度与最大吸收波长的关系。从图1可以看出:不同浓度提取液，最大吸收波长基本一致。随着波长的增大，吸光度出现了2个高峰，第1个峰值出现在波长250nm处;第2个峰值出现在波长550nm处。进一步细化研究条件，得出当波长为212nm、540nm时，吸光度出现高峰。212nm处吸光值不稳，且其吸光值比540nm处值小，结合相关资料［9］，本实验选540 nm作为最大吸收波长。

图1 花椒籽黑色素溶液吸收光谱Fig.1 The absorb curve of themelanin

2.3 单因素实验结果与分析

2.3.1 提取溶剂浓度对花椒籽中黑色素得率的影响 在料液比1∶10(g/m L)、提取温度20℃、提取时间4.5h、提取次数1次的条件下，研究提取溶剂NaOH溶液浓度与吸光度的关系。由图2可以看出，随着NaOH溶液浓度的增加，提取液吸光度先是不断升高。当NaOH溶液浓度达到0.35mol/L时，吸光值达到最高，随后吸光值会逐渐下降。这是因为NaOH溶液浓度升高有助于花椒籽黑色素的提取，但当NaOH浓度过高时，可能会提取出更多杂质，黑色素也可能与其它物质反应，使其结构受到破坏。从而导致吸光值降低［10］。

图2 不同浓度对黑色素得率的影响Fig.2 Effect of different concentration on the extraction rate ofmelanin

2.3.2 提取温度对花椒籽中黑色素得率的影响 在料液比1∶10(g/m L)、0.35mol/L NaOH 溶液、提取时间4.5h、提取次数1次的条件下，研究提取温度与吸光度的关系。由图3可以看出，提取温度对花椒籽黑色素得率有一定的影响，随着温度的升高，花椒籽黑色素得率增加，在65℃达到最大值，但当温度超过65℃时，随着温度的升高，黑色素得率呈下降趋势，这是因为:植物黑色素是一类由酚类单体组成的大分子物质，具有还原性，易氧化，前人研究表明，在氧化过程中，酚羟基转变为醌基。40℃及以下温度对总酚含量的影响无显著差异，但在60℃以后，酚类物质就会发生变化［11］，即黑色素结构被破坏。

图3 不同温度对黑色素得率的影响Fig.3 Effect of different temperature on the extraction rate ofmelanin

2.3.3 提取时间对花椒籽中黑色素得率的影响 在料液比1∶10(g/m L)、0.35mol/L NaOH 溶液、提取温度65℃、提取次数1次的条件下，研究提取时间与吸光度的关系。由图4可以看出，在一定的时间范围内，随着提取时间的延长，花椒籽黑色素得率呈上升趋势，在4.5h达到最大值，之后呈下降趋势，这也可能是由于提取时间过长导致黑色素的分解［6］。而且，随着提取时间的延长会带来其他杂质，会增加后续精制处理的步骤。

图4 不同时间对黑色素得率的影响Fig.4 Effect of different time on the extraction rate ofmelanin

2.3.4 料液比对花籽中黑色素得率的影响 在0.35mol/L NaOH溶液、提取温度 65℃、提取时间4.5h、提取次数1次的条件下，研究料液比与吸光度的关系。由图5可以看出，在一定的料液比范围内，随着液体比例的增加，花椒籽黑色素的得率呈上升趋势，这是因为加水量越大则提取出来的黑色素就越容易溶解，损失就越少，在1∶30时达到最高点，随后随着液体比例的继续增加，花椒籽黑色素得率不再增加，稍呈下降趋势，这是可能因为随着液体比例的增加，会带入杂质。

图5 不同料液比对黑色素得率的影响Fig.5 Effect of different solid to liquid ratio on the extraction rate ofmelanin

2.3.5 提取次数对花椒籽中黑色素得率的影响 在料液比1∶30(g/m L)、0.35mol/L NaOH 溶液、提取温度65℃、提取时间4.5h的条件下，研究提取次数与吸光度的关系。理论上，黑色素得率应该随着提取次数的增加而变大，提取次数越多，提取越充分，直到得率趋于平衡。但实验结果证明:在实验条件下，提取次数增加，得率变化不大。一次提取吸光值为0.3957，二次提取吸光值为0.4007，三次提取吸光值为0.4008。说明一次提取近乎完全，再增加提取次数浪费原料、溶剂和劳动力。因此，综合考虑，提取次数确定为1次为宜。

2.4 响应面分析结果与优化

以提取温度A、提取时间B、料液比C为自变量，以花椒籽黑色素提取液吸光度为响应值(Y)，进行响应面分析实验。实验方案及结果见表3。

表3实验结果经Design Expert软件程序进行多项式拟合回归，建立多元二次响应面回归模型:

各因素的方差分析见表4。

表3 Box-Behnken实验设计表及结果Table 3 The design and results of Box-Behnken experiments

表4 二次响应面回归模型方差分析Table4 ANOVA for response surface quadratics model analysis of variance table

表5 变异系数分析Table 5 Analysis of CV.%

由表4可以看出:模型“Prob＞F”值小于0.01，表明模型是极显著，在统计学上是有意义的;其中A、C、B2、C2对黑色素提取率影响都极显著(p＜0.01)，B、A2、AC 的p值(0.01＜p＜0.05)，表明这些因素对黑色素提取率影响显著。影响花椒籽黑色素提取率的各因素按影响大小排序依次为温度(A)＞料液比(C)＞时间(B)。模型中失拟项p＞0.05，不显著，说明所选模型适宜。同时，由软件分析得到的模型的相关系数 R2为94.63%，变异系数(C.V%)值为3.29%，说明模型方程能够很好地反映真实的实验值，可以利用该回归方程确定最佳条件。

为进一步直观说明提取温度、提取时间和料液比之间的交互作用和对提取液吸光度的影响，通过Design-Expert软件绘制响应面曲线图，进行可视化的分析。从3个三维响应面图(图6～图8)可以直观地观察到每个自变量对响应值的影响。

图6 时间与温度对黑色素得率的响应曲面Fig.6 Curved surface of time and temperature to extraction of melanin

图7 料液比与温度对黑色素得率的响应曲面Fig.7 Curved surface of temperature and solid to liquid ratio to extraction of melanin

图8 料液比与时间对黑色素得率的响应曲面Fig.8 Curved surface of time and solid to liquid ratio to extraction of melanin

由图6～图7可知:随着温度的增加，黑色素得率也增加，当温度达到66.32℃时，黑色素得率达到最高，随后会减小。这可能与过高温度会破坏黑色素结构有关。由图6和图8显示:随着时间的延长，黑色素得率先增加，当时间超过4.46h，黑色素得率会减小，这可能是黑色素长时间接触碱液会分解，从而导致吸光度降低。图7～图8表明:随着料液比增加，黑色素得率会下降，这可能与增加提取溶剂，增加了杂质的溶出量有关。

通过回归模型预测花椒籽黑色素提取的最佳工艺为:提取时间为4.46h、提取温度为66.32℃、料液比为1∶32.94(g/mL)。在该条件下得到最大的吸光值为0.3083。考虑到实际操作的可行性，将理论值修正为:提取时间为 4.5h、提取温度为 66℃、料液比为1∶33(g/mL)，采用此工艺条件进行验证实验，实际测得提取液吸光度为0.305，与理论值相差不大，说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，具有一定的实际价值。

3 结论

3.1 比较分析了三个因素对提取花椒籽中黑色素提取率的影响大小，依次为温度＞料液比＞时间。

3.2 花椒籽黑色素提取的最佳工艺，即提取时间为4.5h、提取温度为66℃、料液比为1∶33(g/mL)。在该条件下花椒籽黑色素提取液吸光度值为0.305。

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