14-3-3蛋白在植物碳氮代谢中的作用

何天久 ，宋波涛 ，夏锦慧 ，谢从华

（1.贵州省生物技术研究所，贵阳，550006；2.华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室）

14-3-3蛋白最早由Moore B和Perez V于1967年在哺乳动物脑部酸性可溶性蛋白中发现，并根据其在DEAE纤维素层析中的片段数与淀粉凝胶电泳中的位置命名[1]。其后约20 a时间里，人们普遍认为14-3-3蛋白仅仅存在于动物脑部，与神经元的功能有关[2～4]。但是近期的研究表明，14-3-3蛋白存在于所有调查过的真核生物的所有器官和组织中[3]，含有14-3-3蛋白的组织数目之大，说明其功能涉及到许多生命活动过程[2]；而在所有调查过的原核生物中都不存在。

14-3-3蛋白是蛋白质与蛋白质质检相互作用的“桥梁”，能与多种蛋白质相互作用，几乎参与生命体的所有生理反应过程。近年来越来越多的研究者对其在植物糖代谢中的调控作用开展了深入研究。本文根据近年来的研究进展，就14-3-3蛋白在植物糖代谢的作用加以介绍，为进一步研究14-3-3蛋白在生产实践中的应用研究提供理论依据。

1 14-3-3蛋白的结构

14-3-3蛋白全长241～268个氨基酸，每一个14-3-3蛋白单体可以分为3个部分：氨基端、保守的中心区域（也有译作核心区域）和羧基端，目前对14-3-3蛋白三维结构的认识来源于通过对哺乳动物ζ和τ两类同工型晶体X-射线衍射建立的模型，14-3-3蛋白保守区域氨基酸序列的高度保守性使得该模型可被应用于所有已知的14-3-3蛋白[2]。14-3-3蛋白的三维结构如图1所示，每个单体各由9个螺旋构成，呈L形，L形内部由4个螺旋组成，A3和A5含有许多带电或是极性的氨基酸，A7和A9含疏水氨基酸，这4个螺旋形成一个两亲性的凹槽，可与靶蛋白发生反应，同源或异源的两个单体按照反向平行排列，构成完整的14-3-3蛋白[5]。对目前所知的各同工型的全长序列分析表明，14-3-3蛋白内部凹槽的的保守性在70%以上，其中5个保守性最高的区域分别位于螺旋 A1、A3、A5、A7和A9上，该凹槽是14-3-3蛋白配体结合位点，也是其主要的功能区域[2]。14-3-3蛋白单体的二聚化反应发生在一个单体的螺旋A1的氨基端和另一个单体的螺旋A3及A4之间[2,5]，各同工型间螺旋A1、A3上高度保守的氨基酸序列使得14-3-3蛋白可以形成异源二聚体，两个相同或是不同的靶蛋白可以同时与二聚体结合，暗示14-3-3的功能可能包括作为衔接蛋白将分离的靶蛋白聚到一起，或者移动/重排同一蛋白的不同功能域[2]。

图1 14-3-3ζ蛋白与底物形成的复合体结构示意图[5]

对哺乳动物丝氨酸/苏氨酸激酶Raf-1与14-3-3蛋白的结合位点的研究，发现14-3-3蛋白结合位点的一段共有序列RSxPSxP（x代表任意氨基酸，P代表磷酸化位点）[6]，该序列存在于所有被筛选的多肽文库中[2]或者RXY/FXpSXP[7]。作为14-3-3蛋白配体的一个普遍但不绝对的特征是靶序列内丝氨酸或苏氨酸的磷酸化[2]。但是，并非所有可与14-3-3蛋白结合的配体都有磷酸化的共有序列，有的非磷酸化序列如GHSL，WLDL也可与之结合[8]。

对于具有磷酸化靶序列的受体蛋白而言，其靶序列与14-3-3蛋白的结合是信号传导过程中的主要步骤[2]，靶序列磷酸化使得受体蛋白构型发生改变，能够与14-3-3蛋白结合，当与14-3-3蛋白结合上之后，才使得受体蛋白构型改变到完成信号传导所需的状态[3]。试验结果表明，14-3-3ζ序列中Lys49，Arg56，Arg127可与受体磷酸化的氨基酸反应；无论是磷酸化受体还是非磷酸化受体都结合在两亲性凹槽内[2]。

14-3-3蛋白中心区域高度保守，绝大多数变异发生于N和C端。事实上，N端氨基酸的保守性仅14%，而C端氨基酸仅有极小的保守性[3]。

2 14-3-3蛋白的种类

依据氨基酸序列和基因结构，植物来源的14-3-3蛋白可以分为两个亚类：ε类和非ε类[2,3]，随着拟南芥全基因组测序的完成，通过分析，确定拟南芥14-3-3蛋白家族由13种同工型组成，其中ε类包括 5 个成员：μ、ε、π、ο、ρ，分为 2 个亚类：ε、π 属于一个亚类，μ、ο、ρ属于另一个亚类；非ε类包括8个成员：κ、λ、φ、ν、υ、ψ、χ、ω，分为 3 个亚类：κ、λ，φ、χ、ω，ν、υ、ψ， 在其他含有 14-3-3 蛋白的物种内也发现有类似的多样性[2]。

在马铃薯中，已发现4种14-3-3蛋白同工型的全长序列和2种同工型的部分序列,包括16r、20r、 29g、30g、34g 和 35g[10]。 从 3 个分别来自叶片、表皮和根部的cDNA文库中筛选到6个编码14-3-3蛋白的全长cDNA序列，其氨基酸序列同源性高达65%～95%[11]。在同属茄科的番茄中已发现了10种14-3-3蛋白同工型，通过系统比较，可以预言：马铃薯中存在与番茄TFT7、TFT8、TFT9同源的同工型，但是番茄叶片中的TFT8、TFT9在壳梭孢（菌）素处理时表现受到显著的正调节，因此，马铃薯中与之同源的同工型可能在那些已检测的普通组织来源的cDNA文库中并不存在[12]。

3 14-3-3蛋白在植物体内的表达与分布

3.1 14-3-3蛋白在植物体器官中的表达与分布

14-3-3蛋白广泛分布于植物的各个器官和组织。Wilczynski等的研究表明，14-3-3蛋白在植物体内的分布具有器官组织特异性，其表达受到发育阶段的调节。该结论得到后续研究的支持，同时Western blot还表明马铃薯叶片中14-3-3mRNA的总含量随着叶片的衰老而减少[10]。Szopa[9]利用Northern blot分析马铃薯中已知的6种14-3-3蛋白同工型在各个不同器官组织内的分布情况，显然，各同工型在不同的器官中表达量不同，同一器官中不同的同工型之间表达量存在很大的差异。分析各同工型在沿茎的相邻叶片中的分布可以发现：除35g外，14-3-3蛋白的各同工型在叶片中的含量从生理上端到生理下端 （随叶片生理年龄的增加）呈一定的梯度分布，说明14-3-3蛋白的表达可能受到所在组织的生理年龄的调控[9,12]，荧光蛋白标记检测也证明了上述结论[13]。

14-3-3蛋白表达的组织特异性是其启动子序列特征的反映。对马铃薯14-3-3蛋白同工型16R的假定启动子区的分析表明，多数功能区域都能被Dof蛋白、E/ABRE-like Box识别[9]。有研究表明，Dof蛋白在体内作为转录起始区域[13]；而在β-菜豆素基因启动子中，E-box定位于不同位点对基因表达起到协同调控的作用[14]；AGAAA序列在番茄花粉中随发育进程调节late 52基因的表达[15]；－300 element被证明是大麦醇溶蛋白、麦醇溶蛋白、麦谷蛋白基因的增强子元件，转录因子Jun和GCN4与该功能域结合[16]；ARE结合位点的存在使得16R启动子受到生长素IAA的强烈诱导；而GATA Box、I-Box和GT1 box与高度的光调控和组织表达特异性有关，后者可以稳定TFIIA-TBP-DNA复合体，SEF4结合位点的存在暗示这3种元件构成一个增强子发挥作用[9]，类似于大豆基因编码存储蛋白时的情况[17]；14-3-3蛋白的高表达可能与SAR/MAR序列有关[18]，该序列与染色质同核基质的结合有关，而与核结构结合的基因都是高度活化的；蔗糖调节基因中的保守序列AATAGAAAA可能对于启动子的活化很重要，因为有结果表明14-3-3蛋白同工型16R基因受蔗糖含量或是蔗糖代谢产物的控制，14-3-3蛋白的活性可能与韧皮部的装载有关[9]。

3.2 14-3-3蛋白在植物细胞内的分布

14-3-3蛋白广泛分布在细胞内，这与它作为各种成分参与到多种蛋白质间的相互作用的观点相符合，但是，某些特殊的亚细胞定位表明某些同工型具有特化的组分。利用同工型特异的抗体及14-3-3蛋白与绿色荧光蛋白融合获得了拟南芥中8类同工型的亚细胞定位，表明特定的同工型有特异的细胞内定位，同时，拟南芥的5条染色体上都至少有1种14-3-3蛋白同工型分布[2]。在转基因拟南芥中，通过羧基端融合绿色荧光蛋白对同工型κ和υ的定位研究表明，同工型κ趋向于定位在原生质膜，而同工型υ则趋向于定位在细胞质中[19]。通过免疫显微技术对细胞核内容物的检测发现，细胞核内至少分布有5类14-3-3蛋白同工型[20]。同工型ε和μ在淀粉颗粒中有分布[21]。

4 14-3-3蛋白在植物糖代谢中的作用

Sehnke等[21]通过在拟南芥中反义抑制14-3-3蛋白同工型GF14ε和GF14μ，发现与野生型比较，反义植株叶片中淀粉总含量增加近2倍，可萃取的淀粉含量提高近4倍，碘染后淀粉颗粒中碘-淀粉复合体的吸收光谱表明，反义植株来源的碘-淀粉复合体吸收光谱较野生型来源的向蓝光波长移动，说明反义植株中支链淀粉含量增加，对两种来源的淀粉的可糊化程度的分析也支持了这一论断。经测定，在反义植株中淀粉的降解速度为1.3～1.5mg·g-1·h-1，而在野生型中淀粉降解速度约为1mg·g-1·h-1（湿重），说明前者的淀粉降解途径完全启动，而负调控的减少时其淀粉含量的增加，进一步说明14-3-3蛋白在淀粉代谢中起抑制作用，通常关闭淀粉的合成[21]。

体外试验结果表明，SPS的活性在很大程度上受到14-3-3蛋白的控制[7,12]。在Szopa J等[11]的试验中，通过反义抑制考察了马铃薯14-3-3蛋白同工型20r和29g在糖代谢中的作用，结果表明，叶片中焦磷酸蔗糖合成酶SPS的活性在所有转基因植株中都显著升高，但是蔗糖含量并没有相应的上升，推测可能是由于增加的蔗糖迅速地被用于多种代谢途径中碳骨架的合成。在另一个试验中，结果有所差异，在SPS活性最高的系列中蔗糖含量比对照增加了近4倍，而其余的转基因植株中蔗糖含量与对照差异不大，分析认为，14-3-3蛋白的总量对酶的活性的控制作用比单独某一个同工型的作用更加重要[12]。何天久等[22]研究发现，在转Sb14-3-3干涉载体马铃薯块茎贮藏过程中，还原糖积累速率随目的基因表达量的降低而减慢，与该过程伴随发生的是蔗糖积累的同时减慢，推测Sb14-3-3可能参与马铃薯块茎低温糖化调节途径。

Szopa等[9，11]的试验中还观察到 α-酮戊二酸含量的上升，以及与之相关联的谷氨酸/焦磷酸谷氨酸含量的增加，同时葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸、柠檬酸、苹果酸的含量都显著上升，表明在反义植株中糖酵解与TCA循环之间生化途径的活化。

通过对参与TCA循环的各种酶在反义抑制20r和29g马铃薯植株中活性检测发现，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPcase和柠檬酸合成酶的活性显著上升，而丙酮酸激酶的活性上升并不显著，检测还发现马铃薯块茎中天冬氨酸/天冬酰胺和谷氨酸－焦谷氨酸/谷氨酰胺的含量上升，可能是由于柠檬酸和苹果酸含量上升对下游代谢的刺激造成的[7]。

马铃薯块茎中，SPS的活性在反义抑制20r和29g的植株中也显著上升，而当反义抑制20r或者同时抑制20r和29g时，葡萄糖和淀粉的含量增加，而焦磷酸葡萄糖和果糖的含量在分别抑制20r和29g时并不受影响，在同时抑制两者时下降，说明14-3-3蛋白对叶片和块茎中SPS的活化途径不同。

在反义抑制14-3-3蛋白的植株中，块茎、叶片中淀粉含量普遍升高[7,11,12,21]，因此推测淀粉合成的关键酶SuSy活性受到14-3-3蛋白的的调控，但是检测结果表明，块茎中SuSy活性仅有极小幅度的上升，同时体外试验也说明14-3-3蛋白对SuSy活性没有影响，另外两个糖代谢中的重要酶AGPase和UGPase的活性也没有受到影响，因此，块茎中淀粉含量的上升可能是由于SPS的活性升高所致[12]。

免疫电镜技术检测表明，野生型拟南芥叶绿体淀粉颗粒密布有非ε类的14-3-3蛋白同工型，而ε类的14-3-3蛋白同工型分布较为稀少，说明除同工型ε和μ外，非ε类的14-3-3蛋白可能与淀粉合成有关（尚无相关的数据可以证明），这些同工型之间的关系以及14-3-3蛋白活化时是同源还是异源二聚体等问题都尚待研究。通过分析商品化的玉米来源的淀粉也含有14-3-3蛋白，说明其对淀粉合成的调节作用也存在于拟南芥以外的其他作物以及叶绿体以外的其他质体中[21]。

通过对已知的淀粉合成相关酶类序列中14-3-3蛋白结合序列的调查，SSⅢ家族极有可能是其在叶绿体中的靶蛋白[21]。值得注意的是，SSⅢ蛋白与支链淀粉的合成直接相关，且对其他的SS同工型有显著的控制作用。

与参与糖代谢的其他物质不同，淀粉在所有的14-3-3蛋白抑制表达植株中，含量几乎都表现为上升[7,11,12,21]，虽然这其中不能排除SPS的活性上升的作用，但是至少还有两种因素需要考虑，第一，研究发现，14-3-3蛋白可以影响马铃薯体内的儿茶酚胺的含量，并进而改变可溶性糖与淀粉的比例；第二，在拟南芥中检测到14-3-3蛋白与淀粉磷酸化酶之间的直接反应对淀粉合成有影响。因此，有至少两条可能增加淀粉合成的途径是对14-3-3蛋白依赖而对SPS不依赖的[12]。

5 展望

14-3-3蛋白表达广泛，功能复杂，引人瞩目，已有200多种蛋白质被证明可以在体内与它相互作用，其中包括各种蛋白激酶、受体、支架蛋白、细胞周期调控蛋白、转录因子和凋亡调控蛋白、线粒体、叶绿体前体蛋白等[23]。14-3-3蛋白参与植物中很多生理过程调控，如参与植物对各种疾病和环境胁迫的应答，在抵御疾病和抗胁迫中起重要作用；14-3-3蛋白通过对蔗糖磷酸合成酶活性的调节从而控制植物碳氮代谢来改变植物吸收氮营养的能力[24,25]。14-3-3蛋白调节植物糖代谢的关键酶活性，研究其在植物糖代谢中的作用，来提高作物产量和改良作物品质具有重要的理论和实际意义。

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