巴戟天低聚糖对Aβ25-35致拟痴呆模型大鼠学习记忆障碍的影响

陈地灵，张 鹏，林 励，张鹤鸣，刘颂豪

巴戟天为茜草科植物巴戟天(Morinda Officinalis How.)的干燥肉质根。味甘、辛，性微温，有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。主要分布在福建、广东、广西、海南等省的热带和亚热带地区，是我国著名的“四大南药”之一。巴戟天中主要含有糖类、蒽醌、氨基酸、脂类、有机酸等化合物及无机元素［1］。其中，低聚糖类物质含量高，成分复杂，药理作用明显［2－10］，近几十年来随着糖类生物学的飞速发展，糖类化合物结构的复杂性和多样性被阐明，它们所担负的众多生物学功能被人们所认识，在药物化学领域，糖类药物的研究也愈来愈受重视，被认为是当前药物发现先导物的重要来源之一。中医理论认为:肾为先天之本，肾藏精，主骨生髓，上通于脑。人的视、听、嗅、感觉及思维、记忆等皆出于脑。因此中医有“从肾论治”的治则来治疗痴呆病症。为阐述补肾药巴戟天的补肾益脑作用，初步探讨巴戟天低聚糖补肾益脑药效作用及机制，为巴戟天新药研究与开发提供基础，同时也为补肾中药在神经退行性疾病方面的研究提供参考，作者开展了本项研究。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器 桌面型数字式双臂大鼠脑立体定位仪(瑞沃德生命科技有限公司);JM12001型电子天平(d=0.1 g);BP211D电子天平(d=0.01 mg，Sartorioμs德国);HH-S数显恒温水浴锅;Thermo D-37520型高速冷冻离心机(德国Heraeus公司);Phs-25型pH计(上海精密科学仪器有限公司);库仑阵列电化学高效液相色谱仪(美国ESA公司:Model 5600A－16通道检测器，Model 582 solvent Delivery System，Model 542自动进样器，CoularrayWin工作站)，Dionex Tcc-100型柱温箱(美国戴安公司);3K超滤管(PALL公司);佳美SK-1快速混匀器(江苏金坛市佳美仪器厂)。

1.2 试药 Aβ25-35(A4559-1 mg，Sigma公司)，聚集态的Aβ25-35形成:取Aβ25-35用无菌生理盐水配制成2 g·L－1，在37℃保温箱中放置7 d，使其变为聚集态的Aβ25-35，－20℃保存备用;安理申片(中国卫材药业);重酒石酸去甲肾上腺素(NE，批号100169-199402);盐酸多巴胺(DA，批号100070-200405);5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA，批号140737-200501);5-羟色胺盐酸盐(5-HT，批号111656-200401);以上四种对照品均购自中国药品生物制品检定所(供含量测定用);乙腈(色谱纯，默克公司，批号 1489730-925)，其余试剂均为分析纯。

1.3 实验动物 SD大鼠，SPF级，3月龄，84只，雄性，体质量180 g～220 g，饲养环境SPF级，广州中医药大学实验动物中心，动物质量合格证号:SCXK(粤)2008-0020，动物使用许可证号:SYXK(粤)2008-0085。

2 方法

2.1 动物分组及造模、给药方案参考文献［11］，并根据实际情况做适当修改，SD大鼠适用性饲养3 d后，用30 g·L－1的戊巴比妥钠(40 mg·kg－1)麻醉后，头顶部去毛，消毒皮肤并切开，在颅骨上用牙钻对称打两个孔(AP-3.6 mm，ML±2.5 mm，DV3.0 mm)即为海马区注射点。每侧注射5 μl(10 μg)聚集态的Aβ25-35，在5 min内注完，并留针5 min。用骨蜡填补针孔，缝合皮肤并肌肉注射青霉素。假手术组注射等量的生理盐水，单笼饲养至大鼠完全清醒。手术后d 15分组给药。

巴戟天低聚糖(OMO，自制，经鉴定其纯度＞95%)加蒸馏水配成20 g·L－1，备用。阳性药安理申(盐酸多奈哌齐片)研碎用前蒸馏水配置成混悬液 0.125 g·L－1，备用。

Tab 1 The experimental classification and dosage of administration

2.2 行为学检测 采用水迷宫实验判断大鼠学习记忆和认知能力，实验方法参照文献［12］，并做适当修改，以定位航行、空间探索为指标，记录大鼠在120 s内寻找平台潜伏期及路程，以及大鼠在120 s内在原平台象限内停留的时间及路程。实验总共进行5 d，前4 d定位航行实验，第5 d空间探索实验。

2.3 OMO对模型大鼠脑组织中单胺类神经递质的影响 测定方法按课题组前期建立方法［13］进行测定。

2.4 OMO对模型大鼠脑组织病理特征的影响

水迷宫实验结束后，取大鼠脑组织，固定于4%多聚甲醛溶液中，常规石蜡切片，厚度为5 μm，进行苏木素－尹红(HE)染色，在2×400高倍显微镜下，进行海马椎体细胞，海马CA1区、大脑皮质和前脑基底核神经元计数。

2.6 统计学处理 实验数据用SPSS 16.0统计软件进行各实验组间的比较，用Dunnett’s检验进行各实验组与对照组比较。

3 结果与分析

3.1 行为学检测结果 水迷宫定位航行实验潜伏期结果显示，见Tab 2。潜伏期，与空白组比较，模型组显著延长，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而假手术组差异无统计学意义(P＞0.05)。说明造模更具显著性，手术本身不造成伤害。与模型组比较，给药组潜伏期明显缩短并趋于稳定，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

Tab 2 Effect of OMO on escape latency ofAβ25－35-treated rats in MWM

水迷宫定位航行实验总路程结果显示，见Tab 3。与空白组比较，模型组航行路程延长，差异具有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，给药组航行总路程缩短，实验进行到第4 d，差异更具有统计学意义(P＜0.01)。

Tab 3 Effect of OMO on escape latency ofAβ25－35-treated rats in MWM

空间探索实验，见Tab 4，各组总路程差异没有显著性(P＞0.05)，提示各组大鼠在120 s内游泳距离没有差异，说明实验对大鼠游泳速度没有影响。空白组大鼠在第一象限(即平台原所在区域)游泳时间(27.36±3.38 s)长于其他象限，且差异具有显著性，说明大鼠已对平台形成记忆。与空白组比较，模型组在第一象限游泳时间(20.77±5.63 s)明显较短，说明 Aβ25－35具有损害大鼠学习记忆功能，OMO高剂量组(31.93±3.39 s)，差异具有统计学意义(P ＜0.01)，提示 OMO 具有改善 Aβ25－35致大鼠记忆功能障碍作用，其余各组差异没有统计学意义(P＞0.05)。与模型组比较，各给药组在第一象限游泳时间明显延长，且差异具有统计学意义(P＜0.01)。

3.2 单胺类神经递质测定结果 由Tab 5可知，与空白组比较，模型组中5-HIAA和5-HT含量差异具有统计学意义(P＜0.01)，提示 Aβ25－35对大鼠单胺类神经递质有影响;假手术组差异没有统计学意义(P＞0.05)，提示手术本身对其无影响。与模型组比较，各给药组 NE、DA(除安理申 DA含量)、5-HIAA和5-HT含量升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，提示OMO具有促进Aβ25－35拟痴呆大鼠模型脑组织中NE、DA、5-HIAA和5-HT等水平升高的功能。

Tab 4 The results of spatial probe test on rats treated by Aβ25－35

Tab 5 The results of neurotransmitter in brain tissue of Aβ25－35-treated rats

3.3 椎体细胞和神经元计数 实验结果显示，结果见Fig 1，与空白组比较(30±2)，模型组(15±3)5个视野的海马CA1区椎体细胞总数明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)，高剂量组(44±4)总数比空白组明显多(P＜0.01)，其余各组差异无统计学意义(P＞0.05);与模型组比较，各给药组海马椎体细胞总数明显增多，差异具有统计学意义(P＜0.01)。同时与空白组(477±52)比较，模型组(378±60)5个视野的海马CA1区神经元总数明显少于空白组，差异具有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，各给药组神经元总数明显增多，差异均有统计学意义(P＜0.01)。

Fig 1 The results of vertebral cells and neurons of hippocampus on Aβ25－35-treated SD rats

Fig 2 The results of vertebral cells and neurons of cerebral cortex and nucleus of Meynert on Aβ25－35-treated SD rats

大脑皮质和前脑基底核神经元计数结果显示，结果见Fig 2，与空白组比较，模型组神经元计数明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，给药组神经元总数明显增多，差异均有统计学意义(P＜0.01)。

4 讨论

学习记忆既是认知活动中的重要方面，也是智力结构中的重要要素。学习和认知记忆功能体现了脑的高级整合功能，其功能的减退、甚至丧失是脑衰老的一个重要标志。AD患者的临床表现为智力减退、近期记忆缺失，以及相关行为能力障碍，所以在AD的诊断和疗效评价指标中，学习记忆水平是最重要的因素。Morris水迷宫于20世纪80年代初设计并应用于学习记忆脑机制研究的，其优点是能提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平;将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测的干扰;操作简便，数据误差较小等。本实验水迷宫实验结果表明，Aβ25－35模型组定位航行潜伏期明显长于空白组，定位航行总路程明显高于空白组，提示 Aβ25－35具有神经毒性，可模拟痴呆长时记忆障碍特征［14］，提示本实验动物模型造模成功。给予OMO治疗后，与模型组比较，大鼠记忆明显改善，说明OMO具有改善痴呆模型大鼠记忆障碍的作用。

现代研究表明，学习、记忆功能的完善与中枢神经功能的健全密切相关，由于衰老，大脑皮层出现萎缩导致神经兴奋性下降、神经递质合成减少甚至丧失。研究发现，单胺类神经递质对学习记忆功能起着重要的调节作用。AD的神经化学变化涉及肾上腺素能、多巴胺能、5-羟色胺能等多个神经递质系统［15］，随着机体的老化，会出现学习记忆能力的下降，同时脑内单胺类神经递质的代谢亦发生紊乱，出现NE、DA、5-HT等含量的下降，提示衰老过程中脑内单胺类神经递质的平衡遭到破坏，并与一些老年性疾如老年痴呆及脑功能的减退有关［16，17］。本研究结果显示，大鼠双侧海马区注射Aβ25－35可致大鼠脑内单胺类神经递质含量降低，给予OMO处理后，其水平恢复到正常，提示OMO改善学习记忆障碍与提高大脑神经递质水平有关。

近年发现，神经退行性疾病患者的特定神经组织具细胞凋亡的形态学特征，提示细胞凋亡可能参与这些疾病的病变过程［18］。还有人发现过度表达突变型APP的转基因小鼠的海马及皮层中有细胞凋亡［19］。这些证据都提示细胞凋亡参与AD的病变过程。本实验结果显示，OMO具有抑制大鼠脑组织中海马CA1区、皮质和前脑基底核神经元细胞的减少，提示其机制可能是抑制神经元凋亡，从而达到抑制脑衰的发展，但其具体生物机制有待进一步深入研究阐述。

本实验结果在一定程度上说明了补肾要药巴戟天低聚糖成分具有一定的提高学习记忆能力，与中医脏象理论“肾主骨，生髓，通脑”相通，提示巴戟天可应于神经退行性疾病的防治，但其作用机制有待进一步深入研究阐明。

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