三七皂苷R1对肺高压大鼠模型肺动脉的舒张作用

胡 莹，焦海霞，王瑞幸，郭立成，穆云萍，林默君

肺高压(pulmonary hypertension，PH)是指由异源性疾病和不同发病机制引起的以肺动脉压力增高为表现的疾病状态［1－2］，其主要病理改变为肺血管阻力进行性增加，进而引起肺动脉压力增高、肺血管重塑，最终引起右心衰竭甚至死亡［2］。所以，PH属于进展性疾病，严重威胁人类健康。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterialsmooth muscle cells，PASMCs)膜上主要存在3种钙离子通道:L-型电压依赖性钙离子通道(L-VDCC)、受体操纵性钙离子通道(receptor-operated calcium channels，ROCC)和钙池操纵性钙离子通道(store-operated calcium channels，SOCC)，这3个通道共同参与细胞内Ca2+稳态的维持［3］。我们先前的工作证实，在慢性低氧(chronic hypoxia，CH)暴露和野百合碱(monocrotaline，MCT)单剂量注射诱导的两种PH模型的肺动脉(pulmonary arteries，PAs)上，SOCC 表达上调，所介导的钙池操纵性钙内流(store-operated calcium entry，SOCE)和血管收缩均明显增强［4－5］。目前，PH治疗药物主要包括前列环素、内皮素以及NO类似物［6］，但这些药物仅能部分改善PH症状，对PH预后并不理想。

三七总皂苷(panaxnotoginseng，PNGS)是从传统中药三七中提取的活性成分，具有抑制由二磷酸腺苷(ADP)引起的血小板聚集、扩张脑血管、抗血栓和抗凝血作用。三七皂苷R1(notoginsenoside R1)是PNGS的主要活性成分之一［6］，近期有研究发现［7］，三七皂苷R1能够抑制血小板膜上的非电压依赖性Ca2+通道介导的Ca2+内流，降低血小板活性。但这种传统中药单体能否抑制PH大鼠肺动脉平滑肌细胞膜上SOCE的作用目前未见报道。本研究采用CH和MCT致PH模型，检测三七皂苷R1对模型大鼠肺动脉的舒张效应，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 两种肺高压模型的建立 健康SD大鼠，♂，体质量180～200 g，购自福建医科大学实验动物中心［SCXK(闽)2012－0001］，随机分成正常对照组(CON组)、慢性低氧模型组(CH组)和MCT模型组(MCT组)。CON组:SD大鼠正常饲养3周;CH组:大鼠置于常压、密封的有机玻璃箱内饲养，箱内的氧分压降至10.0%±0.5%;MCT组:SD大鼠以20 mg·L－1的MCT按60 mg·kg－1剂量一次性腹腔注射。两种模型大鼠均正常饲养3周。

1.2 右心室内压测定 SD大鼠腹腔注射肝素(Heparin，50 IU·kg－1)，5 min 后氨基甲酸乙酯(1 g·kg－1)腹腔麻醉，做右颈外静脉插管直到右心室，记录大鼠右心室平均内压(mean right ventricle pressure，MRVP)和右心室收缩压 (right ventricle systolic pressure，RVSP)。

1.3 右心室重量指数测定 测完右心室内压，迅速开胸取出心脏及肺。沿房室交界处剪去左右心房及大血管，分离右心室(RV)及左心室+室间隔(LV+S)，用滤纸吸去多余水分，分别称重，计算RV/(LV+S)，即右心室重量指数 (right ventricular mass index，RVMI)。

1.4 肺动脉血管张力检测 测完右心室内压，迅速开胸取出肺叶，在体视显微镜下分离肺叶内的肺小动脉，并将其剪成约4～5 mm的肺动脉环，将去内皮后的血管环置于四腔浴槽中，并予1 g负荷，经换能器转换后在RM6240C多道生理记录仪(成都仪器厂)上描记张力曲线，平衡2h。实验前给予60 mmol·L－1KCl收缩血管，重复3次，连续两次得到的收缩幅度差小于10%则认为标本反应可重复，否则弃之。血管环加入苯肾上腺素(终浓度0.1 μmol·L－1)，待预收缩反应达平台后，加入乙酰胆碱(10 μmol·L－1)，观察其对血管的舒张效应，以验证血管环内皮去除与否，血管环出现明显舒张的弃之。随后，观察内皮素-1(Endothelin-1，ET-1，Sigma)或环匹阿尼酸(Cyclopiazonic acid，CPA，Sigma)预收缩作用后三七皂苷R1(成都格雷西亚化学技术有限公司)或钆离子(gadolinium，Gd3+，Sigma)的抑制作用，各种药物诱发PAs的收缩作用以60 mmol·L－1KCl收缩效应的百分数来标准化;用以下公式计算阻断剂的抑制率:

2 结果

2.1 PH大鼠模型鉴定 大鼠慢性低氧饲养3周后，MRVP和 RVSP从 CON组(n=17)的(1.5±0.4)kPa和(3.7±0.6)kPa分别增加到CH组(n=17)的(2.6±0.7)kPa(P＜0.01)和(7.1±1.1)kPa(P＜0.01);大鼠以 20 mg·L－1的 MCT按60 mg·kg－1剂量一次性腹腔注射，3周后，MRVP和RVSP分别增加到MCT组(n=21)的(4.0±1.6)kPa(P＜0.01)和(8.1±2.4)kPa(P＜0.01);而CH和MCT组体循环动脉压和心率均没有差别［8］，提示右心室内压增高。RVMI从CON组的27.6%±2.8%分别增加至38.6% ±5.0%(CH组，P＜0.01)和46.7% ±14.1%(MCT组，P ＜0.01)，表明右心重构，右心室肥大，提示两种PH大鼠模型制备成功 (Fig 1)。

Fig 1 Mean right ventricle pressure(MRVP)，right ventricle systolic pressure(RVSP)and right ventricle mass index(RVMI)in different groups

2.2 三七皂苷R1呈剂量依赖性阻断ET-1对PAs的预收缩效应 CON组大鼠观察三七皂苷R1对10 nmol·L－1ET-1预收缩去内皮PAs的剂量依赖性舒张效应。在 3 μmol·L－1的硝苯地平(Nifedipine，Nif)阻断L-VDCC后，以10 nmol·L－1ET-1预收缩PAs，在 ET-1收缩反应达稳定后，加入不同剂量(0.1 ～100 μmol·L－1)的三七皂苷 R1，结果显示:三七皂苷R1呈剂量依赖性阻断ET-1预收缩的PAs，最大舒张效应为Emax为32.5% ±16.3%，EC50为 5.25 ±0.14 μmol·L－1(n=8，Fig 2)。

Fig 2 The dose-dependent curve of notoginsenoside R1 on ET-1(10 nmol·L －1)-preconstricted PAs of control rats

2.3 Gd3+和三七皂苷R1对PH大鼠ET-1预收缩PAs的阻断效应 CH组和MCT组大鼠去内皮PAs经10 nmol·L－1ET-1预收缩达稳定后，加入可特异性阻断SOCC的Gd3+(3 nmol·L－1)后，PAs张力均明显下降，CH组由117.8% ±20.8%下降至31.9%±8.2%(n=15，P ＜0.01)，MCT组由 111.0% ±26.5%下降至30.8% ±9.5%(n=15，P＜0.01)，两组再分别加入6 μmol·L－1三七皂苷R1没有出现进一步的舒张作用(CH组:28.0% ±9.2%，MCT:27.2% ±10.5%，Fig 3)。提示:在 3 nmol·L－1Gd3+特异性阻断SOCE后，三七皂苷R1不能进一步对ET-预收缩的PAs产生舒张作用。

2.4 三七皂苷R1对CPA预收缩PH大鼠PAs的舒张作用 CH组和MCT组大鼠去内皮PAs，肌浆网钙泵特异性抑制剂 CPA(10 μmol·L－1)预收缩达稳定后，分别加入6 μmol·L－1三七皂苷 R1，观察其对CPA预收缩PAs的阻断作用。结果显示，6 μmol·L－1三七皂苷 R1能部分阻断 CPA预收缩PAs效应，CH组由116.9% ±25.2%下降至76.1%±23.4%，抑制率为 39.6% ±17.0%(n=7，P＜0.01，Fig 4);MCT组由105.7% ±30.0%下降至70.3% ±270.8%，抑制率为40.9% ±11.2%(n=14，P＜0.01，Fig 4)。提示:三七皂苷 R1可通过阻断SOCE，舒张PH大鼠的PAs。

Fig 3 Vasorelaxant effects of Gd3+(3 nmol·L －1)and notoginsenoside R1(6 μmol·L －1)on ET-1(1 nmol·L －1)-preconstricted PAs of CH-and MCT-treated rats

Fig 4 Vasorelaxant effects of notoginsenosideR1(6 μmol·L －1)on CPA(10 mol·L －1)-preconstrictedPAs of CH-and MCT-treated rats

3 讨论

三七总皂苷是五加科人参属植物三七的主要有效活性成分，包含多种皂苷单体，具有扩张血管、降低心肌耗氧量、减轻心肌炎损伤、抑制血小板凝集、延长凝血时间、降血脂、清除氧自由基、抗炎、抗氧化等药理作用，主要用于心脑血管系统疾病的治疗［6］。三七皂苷单体R1是三七总皂苷的活性成分之一，对可兴奋细胞及非可兴奋细胞的Ca2+内流都有影响，主要通过调节内皮细胞、血管平滑肌细胞等操纵的Ca2+内流发挥药理作用［9］。然而，三七皂苷R1对PH发病的治疗作用是否与PASMCs膜上的SOCC有关，尚未见报道。

本研究分别采用CH和MCT两种方法，建立PH大鼠模型，结果显示两种模型大鼠的 MRVP、RVSP和RVMI均明显升高，提示两种PH模型制备成功，同时，本研究旨在探讨三七皂苷R1对PH大鼠PASMCs膜上SOCC的作用。Nif是L-VDCC的阻断剂［3］，本研究在Nif预处理排出L-VDCC作用的前提下，采用激动剂ET-1诱发正常大鼠PAs收缩，观察三七皂苷R1对非电压依赖性Ca2+通道介导的Ca2+内流的阻断作用。结果发现，三七皂苷R1能部分舒张ET-1诱发的PAs收缩，且呈剂量依赖性，该结果表明三七皂苷R1可能通过部分阻断非电压依赖性Ca2+通道介导的Ca2+内流，达到舒张肺血管作用。

为明确三七皂苷R1究竟是通过阻断PAs上的何种非电压依赖性Ca2+通道发挥舒张血管作用，本研究选择Gd3+阻断ET-1诱发PAs收缩。Gd3+为镧系元素，对SOCC介导的Ca2+内流有高度的选择性，在很低浓度时即可以将其阻断［10］。本部分研究在Nif阻断L-VDCC的前提下，采用激动剂ET-1诱发PAs收缩，再用Gd3+阻断ET-1诱发的PH大鼠PAs收缩，在此基础上观察三七皂苷R1对PAs的进一步舒张效应。结果证实，在Gd3+阻断PAs收缩后，三七皂苷R1对PAs无进一步舒张效应。提示三七皂苷R1对ET-1诱发PAs收缩的舒张效应是由于部分阻断了SOCC介导的Ca2+内流引起的。

为进一步证实R1通过部分抑制SOCC介导的Ca2+内流舒张PAs，本实验观察三七皂苷R1对CPA诱发PH大鼠PAs收缩的抑制作用。CPA是一种肌浆网Ca2+泵耗竭剂，可特异性触发SOCC介导的Ca2+内流［4－5，11－12］。因此，我们采用 SOCC 激动剂CPA诱发PAs收缩，观察三七皂苷R1对肺动脉血管的舒张效应。结果发现，三七皂苷R1能使CPA诱发的PAs收缩效应部分舒张，而这种作用是通过部分抑制SOCC介导的Ca2+内流引起的。该结果进一步证实了三七皂苷R1可通过部分抑制SOCC介导的Ca2+内流舒张PAs。

总之，三七皂苷R1可能通过阻断钙池操纵性钙内流介导的PAs收缩产生治疗PH作用。

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