三七总皂苷对H9c2细胞P450酶mRNA表达的影响

胡东华，王宇光，陈志武，马增春，梁乾德，肖成荣，谭洪玲，汤响林，高 月

三七总皂苷(panax notoginseng saponin，PNS)是五加科植物三七［Panax notoginseng(Burk)F.H.Chen］的主要活性成分，其在三七中的含量高达12%。PNS中三七皂苷 R1、人参皂苷Rb1、Rg1、Rd和Re为其主要成分，约占总皂苷含量的80%［1］，具有防止脂质在血管内沉积，抑制血管平滑肌细胞增殖，促纤溶及抑制血小板聚集，促进微循环，抗动脉粥样硬化，保护心肌等作用［2－3］。是临床用血栓通的主要成份，主要用于扩张血管，改善血液循环。

细胞色素P450酶(CYP450)最初发现于肝脏中，其在生物转化、药物代谢、解毒等方面进行广泛深入的研究;近年来发现心脏中也含有CYP，并且以CYP2和CYP4家族为代表与心血管疾病密切相关的CYP亚型也成为研究热点，内源性物质花生四烯酸(arachidonicacid，AA)经P450酶途径的代谢产物对心血管系统的影响近年来日益受到重视［4］。近年来许多CYP家族在心脏、血管内皮细胞和平滑肌细胞中得以鉴定，同时很多证据显示内源性物质经CYP的代谢产物在维持心血管内环境稳态中发挥重要作用［5］。研究表明，花生四烯酸可被CYP环氧酶(CYP2C11，2J3)代谢为环氧二十碳三烯酸(EET)或被 CYP ω-羟化酶(CYP4A，4F)代谢为20-羟基二十碳四烯酸(20-HETE)［6］。

以往对于PNS的药理机制研究主要集中在对心肌的保护作用、钙拮抗作用、对抗心肌肥大、抑制心室重构、抑制血管平滑肌细胞的增殖、抗血栓形成和抗动脉粥样硬化、保护血管内皮细胞作用、肝脏P450酶等方面［7－9］。目前尚未见 PNS对心脏细胞色素P450调控的研究，鉴于近年来发现心脏细胞色素P450在心血管系统中同样执行重要功能，PNS作为治疗心脑血管疾病的临床常用药物，其对心肌细胞色素P450影响和机制仍不是十分清楚。本研究利用Real Time PCR方法从心脏P450酶的层面考察PNS处理心肌细胞H9c2，细胞色素P450亚型表达的变化，以评价PNS对心脏P450酶亚型是否有抑制或诱导效应，为进一步深入研究PNS以心脏P450为靶点的心血管药理效应的机制提供线索，同时为指导临床合理用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及药品 PNS［广西梧州制药(集团)股份有限公司］，依据国家药品标准 WS-10460-(ZD-0460)-2002-2011Z检验合格;DMEM和血清(FBS)(Hyclone);胰酶(Sigma);MTS试剂盒(Promega);LDH试剂盒(普利莱基因技术有限公司);PBS(北京凯欣杰生物技术有限公司);RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒(博迈德生物);Trans ScriptTMOne-Step RT-PCR Super Mix(北京全式金生物技术有限公司);Fast SYBR@Green Master Mix(Applied Biosystems)，其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器 细胞培养箱(NAPCO 5410);超净工作台(北京长城空气净化设备公司);倒置显微镜(Nikon 120型);Victor X5酶标仪(Perkin Elmer)PCR仪(Gene Amp 2400);核酸蛋白分析仪 (Beckman DU640);StepOne PlusTMReal Time PCR(Applied Biosystems)。

1.3 细胞培养 H9c2心肌细胞株来源于大鼠胚胎期心脏组织(购自北京协和细胞库)，在37℃、5%CO2的条件下，培养于含有10%胎牛血清和高糖DMEM培养基中，融合率为80% ～90%时，按1∶3的比例传代。

1.4 PNS 母液配制(200 g·L－1)［10］精确称取2.000 g的PNS粉末，加入5 ml的去离子水，缓慢搅拌使其溶解，再加去离子水定容至10 ml，搅拌使其充分溶解;用0.22 μm孔径的微孔滤器过滤除菌;分装至1.5 ml EP管，4℃冰箱保存。

1.5 MTS法检测H9c2细胞活性 用DMEM培养基将对数生长期的H9c2细胞以2×104个/孔密度接种于96孔培养板(空白孔不种细胞)，200 μl/孔，37℃、5%CO2培养 24 h;实验分为空白组，PNS组(浓度依次为 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 g·L－1)和阴性对照组，培养48 h;每孔加MTS液8 μl，继续孵育4 h;用酶标仪测定490 nm处的光密度值(OD);按以下公式计算细胞存活率。

细胞存活率(IC)/%=(实验组OD值－空白组OD值)/(阴性对照组OD值－空白组OD值)×100%

1.6 乳酸脱氢酶比色法(LDH)检测H9c2细胞损伤 对数生长期的H9c2细胞以2×104个/孔密度接种于96孔培养板(空白孔不种细胞)，200 μl/孔，37℃、5%CO2培养24 h;实验分组如上，培养48 h后，按照LDH试剂盒操作说明进行试验，按以下公式计算细胞的损伤。

细胞LDH释放率/%=细胞培养基中测定的酶活力单位/(细胞裂解液测定的酶活力单位+细胞培养基测定的酶活力单位)×100%

1.7 Real Time PCR测定H9c2细胞CYP450 mRNA水平影响 实验分为空白对照组，PNS组(浓度依次为 0.3125、0.625、1.25、2.5、5 g·L－1)接种 6孔板中，给药48 h后取各处理组H9c2细胞，按试剂盒说明提取心肌细胞总RNA，电泳分析表明18S和28S条带清晰可见，A260/A280比值在 1.7～2.0，总RNA片段完整未降解可用。取 2 μg RNA按照TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix说明进行逆转录反应，42℃ 30 min;85℃ 5 min。用 ABI StepOne PlusTMReal Time PCR进行 PCR反应，取2.0 μl逆转录反应产物作为PCR反应模板，加入上下游引物 20 μmol· L－1各 0.5 μl，Fast SYBR@Green Master Mix 10 μl，补充 Rase-free water 至 20 μl。反应参数:95℃ 20 s预变性，95℃ 3 s变性，60℃ 30 s退火，共40个循环。每次扩增设置β-actin内参照，进行PCR扩增产物的实时定量分析，用2－(△△Ct)方法分析。特异性引物序列见Tab 1。

Tab 1 Primers sequence used in Real Time PCR analy

1.8 统计学分析 所有数据重复3次，每次设置3个复孔，收集数据进行统计学分析。实验数据用¯±s表示，采用SAS统计学软件，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 MTS法检测H9c2细胞活性 以PNS(浓度依次为 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20 g·L－1)处理H9c2细胞48 h以后，测定各处理组细胞存活率，结果显示随着三七总皂苷浓度的升高，细胞的存活率逐渐下降。低浓度的PNS对细胞的存活率没有影响(如0.3125、0.625 g·L－1)。用Origin8.0 软件拟合计算IC50(5.28±0.08)g·L－1(Fig 1)。

2.2 乳酸脱氢酶比色法(LDH)检测H9c2细胞损伤 对各处理组细胞的LDH进行测定，结果显示以PNS处理H9c2细胞48h后，随着PNS浓度的升高，乳酸脱氢酶的释放率逐渐增大，与空白组比较，5、10、20 g·L－1组的 LDH 释放率明显增高(P＜0.01)，而 0.3125、0.625、1.25 g·L－1组的 LDH 释放率没有变化(Fig 2)。

Fig 1Effect of PNS on cell viability of H9c2 cells(¯±s，n=5)

Fig 2Effect of PNS on LDH release rate of H9c2 cells(¯±s，n=5)

2.3 PNS对H9c2细胞P450酶 mRNA表达的影响

2.3.1 PNS对 H9c2细胞 CYP2C11和 CYP2J3亚型mRNA水平的影响 PNS对H9c2细胞CYP450酶Ⅱ家族mRNA表达的影响如Fig 3所示，与空白组比较，PNS对CYP2C11有下调趋势(P＜0.05或P＜0.01)，而对CYP2J3有上调作用，且作用比较明显(P＜0.01)。

2.3.2 PNS对 H9c2细胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4A3、CYP4F1、CYP4F4 和 CYP4F5 亚型mRNA水平的影响 如Fig 4所示，PNS对H9c2细胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4F1和CYP4F5有上调趋势(P＜0.01)，并且有一定的浓度依赖性。PNS对CYP4A3和CYP4F4，在低浓度时有下调作用(P＜0.05或P＜0.01)，而在最大浓度时，对这两个亚型有一定的上调作用(P＜0.01)。

3 讨论

Fig 3Effect of PNS on CYP2C11 and CYP2J3 gene expression of H9c2 cells¯±s，n=3)

细胞色素P450(CYPs)酶是混合功能氧化酶系，多表达于肝脏，人体内约有75%的药物通过CYP450代谢［11］。EETs具有抗炎，抑制平滑肌细胞增殖与迁移，调节血管张力，促纤溶，抗动脉粥样硬化等作用，在心脑血管中有着广泛的生物学效应，主要有CYP2C11和 CYP2J3参与［12］。20-HETE在大鼠中主要由CYP450酶4家族代谢，这是一种强有力的缩血管物质，对血压调节有重要影响，主要有CYP4A和4F参与［13］。因此本文从心脏的主要药物代谢酶为研究对象，研究PNS对上述CYP亚型表达的影响，旨在探讨PNS对心血管药理作用新的可能机制。

Fig 4Effect of PNS on CYP4A1，CYP4A2，CYP4A3，CYP4F1，CYP4F4 and CYP4F5 gene expression of H9c2 cells(¯±s，n=3)

MTS的测定结果可以反映细胞的存活程度。细胞受到损伤时，激活一系列的酶促反应造成细胞内LDH大量外释，并且诱导细胞的进一步损伤。通过PNS处理H9c2细胞48 h后，MTS结果表明随着PNS浓度的增大，细胞的存活率逐渐降低，并且呈浓度依赖性，低浓度对细胞的存活率没有影响(如 0.3125、0.625 g·L－1);LDH 的释放率随着浓度的升高而逐渐增大，0.3125、0.625、1.25 g·L－1组的LDH释放率没有变化。提示PNS在高浓度时可能会对细胞有一定的损伤。PNS对大鼠肾小球系膜细胞有一定的抑制作用，并呈剂量依赖性［14］。有研究显示PNS在治疗剂量下对肝脏损伤有保护作用，大剂量(150 mg·kg－1)对大鼠有肝肾毒性，在150 mg·kg－1以上时对心脏功能具有毒性效应［15－16］。结合本次研究结果，提示临床应用此类药物时应注意剂量。

CYP2J2/3主要表达于心脏，且主要合成具有心脏保护作用的EETs，而EETs有扩张血管的作用。大鼠心脏CYP2J3与人类心脏CYP2J2具有70%的同源性。Bhatnagar［17］研究发现 CYP2J对心脏表现为保护作用，而CYP2C则表现为加重损伤，提出CYP450不同亚型可能因产生氧自由基不同，而表现为加重或拮抗心肌缺血/再灌注损伤。PNS各浓度对CYP2C11有下调趋势，而对CYP2J3有上调作用，提示PNS有一定的保护心脏，扩张血管的作用。CYP450酶4家族羟化酶代谢花生四烯酸产生20-HETE，这是一种强有力的缩血管物质。PNS各浓度对 H9c2细胞 CYP4家族中 CYP4A1、CYP4A2、CYP4F1和CYP4F5有上调趋势，而对 CYP4A3和CYP4F4在低浓度时有下调作用，而在最大浓度时(5 g·L－1)，对这两个亚型有一定的上调作用，这可能是高浓度对细胞的影响的结果。

PNS作为临床用血栓通的主要成份，本研究结果显示高浓度的PNS可能会有一定的毒性。同时PNS对CYP450酶不同的亚型有不同程度的诱导或者抑制作用，提示PNS对心脏和血管有一定的保护作用。因此使用PNS时应注意用药剂量，使其发挥疗效而尽量减少药物不良反应的发生，同时在临床应用时注意用药剂量。

［1］ Li X Y，Wang G G，Sun J G，et al.Pharmacokinetic and absolute bioavailability study of total panax notoginsen-oside，a typical multiple constituent traditional Chinese medicine(TCM)inrats［J］.Biol Pharm Bull，2007，30(5):847 －51.

［2］ 李晓宇，孙建国，郑媛婷，等.三七总皂苷对抗H2O2所致大鼠脑微血管内皮细胞损伤的物质基础研究［J］.中国药理学通报，2007，23(8):1030－4.

［2］ Li X Y，Sun J G，Zheng Y T，et al.Protective effect study of major constituent in total panax notoginsenoside on rat brain microvessel endothelial cell(RBMEC)damage induced by H2O2［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(8):1030 －4.

［3］ 吴 颖，孙 冰，肖 静，等.三七皂苷R1对LPS诱导的小鼠心肌损伤的保护作用［J］.中国药理学通报，2013，29(2)179－84.

［3］ Wu Y，Sun B，Xiao J，et al.Protective effect of Notoginesenoside R1 on lipopolysaccharide-induced myocardial dysfunction in mice［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(2):179 －84.

［4］ Roman R J.P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function［J］.Physiol Rev，2002，82:131 －85.

［5］ Elbekai R H，El-Kadi A O.Cytochrome P450 enzymes:central players in cardiovascular health and disease［J］.Pharmacol Ther，2006，112:564－87.

［6］ Roman R J.P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function［J］.Physiol Rev，2002，82:131 －85.

［7］ 沈 央，方晓玲.三七总皂苷脂质体的生理适应性及其对心脑血管的保护作用［J］.中国临床药学杂志，2004，13(5):269－73.

［7］ Shen Y，Fang X L.Panax notoginseng liposomes:physiological compatibility and effects on cardio-cerebrovascular diseases study［J］.Chin J Clin Pharmacy，2004，13(5):269 －73.

［8］ Nah S Y，Park H J，McCleskey E W.A trace component of ginseng that inhibit Ca2+channels through a pertussis toxin sensitive G protein［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(19):8739 －43.

［9］ 李晓宇，刘皋林，周佳纯，等.三七总皂苷注射液对大鼠肝CYP450酶的影响［J］.中国临床药理学与治疗学，2009，14(8):849－54.

［9］ Li X Y，Liu G L，Zhou J C，et al.Experimental study on the effects of liver cytochrome protein 450(CYP450)induced by panax notoginsenoside injection in rats［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther，2009，14(8):849 －54.

［10］陈少贤，杨 敏.三七总皂苷抗缺血诱导的大鼠心肌细胞凋亡的作用及机制研究［D］.中国硕士论文数据库，2010:1－75.

［10］ Chen S X，Yang M.Study of the anti-apoptotic effect and mechanism of panax notoginseng saponin on rat cardiomyocytes induced by ischemia［D］.China’s Master’s Dissertaion Database，2010:1－75.

［11］ Larsen B T，Gutterman D D，Hatoum OA.Emerging role of epoxyeicosa-trienoic acids in coronary vascular function［J］.Eur J Clin Invest，2006，36:293 －300.

［12］ Sun J，Sui X，Bradbury J A，et al.Inhibition of vascular smooth muscle cell migration by cytochrome p450 epoxygenase-derived eicosanoids［J］.Circ Res，2002，90:1020 － 7.

［13］ Zou A P，Fleming J T，Falck J R，et al.20-HETE is an endogenous inhibitor of the large-conductance Ca2+-activated K+channel in renal arterioles［J］.Am J Physiol，1996，270:228 －37.

［14］赵 湘，邱莲女，郭俊华，等.三七总皂苷对大鼠肾小球系膜细胞增殖及细胞周期的影响［J］.中华中医药学刊，2008，26(2):287－9.

［14］ Zhao X，Qiu L N，Gou J H，et al.The effect of total Panax Notoginseng Saponins in regulating the cell proliferation and cell cycle in rat’s mesangial cells［J］.Chin Arch Tradit Chin Med，2008，26(2):287－9.

［15］韩 刚，孙辉业，董延生，等.三七总皂苷对大鼠肝脏肾脏的毒性作用［J］.中国新药杂志，2006，15(24):2115－8.

［15］ Han G，Sun H Y，Dong Y S，et al.Rat’hepatic and renal toxicity of total saponins from panax notoginseng［J］.Chin J New Drugs，2006，15(24):2115－8.

［16］徐 江，彭双清，闫长会，等.三七总皂苷对大鼠心脏血流动力学的毒性作用［J］.中国新药杂志，2009，18(4):345－52.

［16］ Xu J，Peng S Q，Yan C H，et al.Toxice ffects of Panax notoginseng saponins on cardiachemodynamics in rats［J］.Chin J New Drugs，2009，18(4):345 －52.

［17］ Bhatnagar A.Beating ischemia:a new feat of EETs［J］?Circ Res，2004，95(5):443 －5.