基于IgY的ELISA用于囊尾蚴循环抗原的检测

刘 玉，王元伦，唐雨德

囊尾蚴病是我国常见的寄生虫病，俗称囊虫病，其循环抗原(circulating antigen，CA)可以反映囊尾蚴在体内的存活状况［1］，可以用于囊尾蚴病的诊断与疗效考核［2，3］。IgY是特定抗原免疫产蛋母鸡后在鸡卵黄中形成的多克隆抗体，即卵黄抗体(immunoglobulin Y)。本文应用抗囊尾蚴CA的IgY和酶标记抗CA单克隆抗体1A5组合，建立一种新型双抗体夹心ELISA检测囊尾蚴CA，以探讨IgY用于囊尾蚴病免疫诊断的可行性，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 血清与抗体 经CT和药物治疗结合确诊的囊尾蚴病患者样品158份(其中血清139份，脑囊尾蚴病患者脑脊液19份)，分别获自内蒙古通辽囊虫病医院、南京脑科医院、南京军区总医院和南京454医院;经剖检确诊的囊尾蚴病病猪血清222份，采自内蒙古兴安盟科右前旗;健康人血清50份，采自南京的健康体检人员;健康猪血清20份，采自江苏镇江某部队农场;3份弓形虫病患者血清由济南军区军事医学研究所提供，8份包虫病患者血清由新疆军区防疫队提供。抗囊尾蚴CA单克隆抗体1A5由本课题组制备并保存［4］。

1.2 囊尾蚴 CA 由课题组采用亲和层析法纯化［3］，-20℃保存;弓形虫与棘球蚴纯化抗原分别由济南军区军事医学研究所与新疆军区防疫队赠与。

1.3 抗囊尾蚴CA-IgY的制备与鉴定 取500 μg CA与等体积福氏完全佐剂乳化经翅下静脉注射25周龄来亨蛋鸡10只(首次剂量为500 μg/只，加强剂量为200 μg/只)，每次间隔10 d。首次免疫7 d后开始收集鸡蛋。用水稀释法提取IgY［5-6］，－20℃保存备用。采用紫外吸收法测定纯化后IgY的浓度，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其相对分子量和纯度，间接ELISA检测IgY的活性与特异性。

1.4 血清处理方法 采用IC沸浴法［4］。

1.5 抗囊尾蚴CA单克隆抗体1A5的酶标记 采用简易过碘酸钠法［4］标记辣根过氧化物酶(HRP)，HRP为Sigma公司产品。

1.6 IgY-ELISA的方法建立 将IgY按常规包被ELISA反应孔中，洗板后，用100 g/L的脱脂奶粉液(或牛血清清蛋白)37℃封闭2 h，PBS-T液洗涤3次;加入已处理的待测标本100 μl，37℃温育30～60 min后，PBS-T液洗涤3次;加入稀释好的HRP-1A5100 μl，37 ℃ 温育 30 ～60 min，PBS-T 液洗涤 5次，采用TMB显色方法，测定吸光值(A450)。每板均设阳性对照和阴性对照，以A值＞阴性对照的2.1倍作为阳性判定标准。通过正交试验来确定最佳检测条件，设立4个实验因素，每因素设2个水平，分别为IgY包被浓度、血清温育时间、酶标抗体浓度和加酶标抗体后温育时间。

1.7 方法的敏感性与特异性 用已建立的方法检测囊尾蚴病患者血清、脑脊液、病猪血清以及健康人与健康猪血清以及3份弓形虫病患者血清、8份包虫病患者血清并与双单抗-ELISA［4，7］比较，验证方法的敏感性、特异性与可行性。

2 结果

2.1 抗囊尾蚴CA-IgY的鉴定 首次免疫后10 d卵黄内检测到有特异性抗囊尾蚴CA-IgY，加强免疫后效价逐步上升，至30 d，琼脂扩散效价达1∶128，并维持到55 d。每枚蛋黄经提纯后可得到约66.12 mg IgY，经SDS-PAGE分析，纯化后的IgY在约65 ku处和25 ku处可见2条清晰的条带，分别为IgY的重链和轻链(图1)。间接ELISA显示IgY与囊尾蚴CA发生特异反应，ELISA效价大于108，与棘球蚴抗原、弓形虫抗原反应的ELISA效价小于10。

图1 lgY纯化前后SDS-PAGE分析1:低分子量蛋白标志物;2:纯化前IgY;3:纯化后lgY

2.2 双抗体夹心ELISA方法的建立 经正交试验最终确定的检测条件为:IgY包被浓度1∶1000、被检血清温育时间为60 min;酶标记单抗浓度为1∶800，温育时间为30 min。

2.3 灵敏度 IgY-ELISA和双单抗-ELISA检测囊尾蚴 CA 的灵敏度分别为8.3 μg/L 和13.9 μg/L。

2.4 方法的敏感性与特异性 应用IgY-ELISA和双单抗-ELISA对450份样品检测结果比较，差异无统计学意义(P ＞0.05，表1)。

表1 基于IgY和双单抗的夹心ELISA检测结果比较

3 讨论

囊尾蚴CA的检测可作为疗效考核指标［2-3］。建立高敏感性和特异性的CA检测方法是当前囊尾蚴病防治中亟待解决的问题之一。现有的囊尾蚴CA检测方法敏感性与特异性还有待提高，其原因可能是因为CA多为囊尾蚴的代谢分泌物，易受到机体免疫系统的清除，从而导致CA在患者血清中含量不高，独特型抗体的存在也能影响到循环抗原的检测［8-9］。此外，囊尾蚴CA与棘球蚴抗原存在严重的交叉反应［9-10］。应用单克隆抗体作为检测系统，解决了特异性问题，但敏感性降低，而使用多克隆抗体作为检测系统，其特异性较差［11］。

本实验利用IgY的优点［5］，制备出抗囊尾蚴CA的高效价IgY抗体，SDS-PAGE与间接ELISA结果显示，纯化效果较好，可与CA发生特异反应，而与棘球蚴和弓形虫抗原不发生交叉反应。利用纯化的抗囊尾蚴CA-IgY作为捕获抗体、酶标记单抗1A5为检测抗体，建立了检测囊尾蚴CA的夹心ELISA法。其灵敏度为8.3 μg/L，高于双单抗-ELISA 的13.9 μg/L。从表1可知，IgY-ELISA对139例囊尾蚴患者血清、19例脑囊尾蚴患者脑脊液和222份囊尾蚴病猪血清进行检测，CA阳性率分别为100.0%、89.5%和100.0%，而双单抗-ELISA的阳性率分别为97.8%、84.2% 和 100.0%;对 50 份非疫区正常人与20份健康猪的血清检测，CA阴性率均为100%，而双单抗-ELISA则分别为98%和100.0%。两种方法对弓形虫病患者和包虫病患者血清检测，结果均为阴性。经统计学分析，IgY-ELISA与双单抗-ELISA的敏感性与特异性没有显著性差异，但前者的灵敏度似高于后者。

从理论上分析，本文所建立的检测方法采用多抗与单抗夹心的检测模式，多抗针对抗原的位点多［12］，用作捕捉抗体可以提高检测的敏感性;而单抗针对抗原的位点单一，用作检测抗体则可以提高检测的特异性［13］。由于鸡与哺乳动物种系发生学关系较远，且IgY制备及纯化技术简单、成熟，卵黄中提取的IgY纯度高、含量大，将IgY应用于免疫诊断中，可减少假阳性的出现［14］，从而提高检测的敏感性与特异性。

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