广西柳州地区罗非鱼链球菌病病原药敏性分析

黄 杰 罗福广 杨 军 左 跃 易 弋 黄 稀

（1.柳州市渔业技术推广站，广西 柳州 545006；2.广西工学院，广西 柳州 545006；3.国家罗非鱼产业技术体系柳州综合试验站，广西 柳州 545002）

随着罗非鱼规模化养殖的不断扩大，其苗种、水产品流通日趋频繁，加上养殖环境的恶化和养殖户规范用药的意识薄弱，造成各种细菌病尤其是链球菌病在国内呈迅速蔓延趋势，并严重制约罗非鱼产业化的健康可持续发展。据国内外报道引发罗非鱼病害的主要病原多为海豚链球菌（Streptococcus iniae）和无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）[1-6]，发病征兆除一部分为无明显症状和病变的急性死亡外，大多数病鱼都表现为眼突或眼球白色浑浊的典型症状[7]。

养殖户针对细菌病的防治，一般是通过使用各种抗菌药物。长期使用、滥用、乱用现象屡见不鲜，细菌耐药问题日益突显。通过细菌药敏实验实施针对单一型或者混合型细菌疾病的诊疗服务，在兽医临床诊断和指导用药中已经普遍应用，而在水产养殖过程中，大多数还是采用传统的细菌病防治方法。本文通过纸片扩散法（K.B法）[8]，从柳州地区患病罗非鱼体内分离病原菌并进行药敏性分析，为本地区链球菌病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验对象

患病的罗非鱼来自2012年广西柳州地区10个暴发链球菌病的养殖场（编号依次为D1、D2……D10）。

1.2 实验材料

血琼脂平板、药敏纸片分别购自郑州安图绿科生物工程有限公司、杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 病菌分离纯化

对眼突、水面转圈独游等典型链球菌病症状罗非鱼的脑、肾、肝、脾取样，划线接种血平板后室温培养 24h，挑取镜检为链状球菌的优势菌落进行纯化，得到11个菌株。菌株依次编号为C1、C2……C11，菌株采集和养殖场情况见表1。

1.4 药敏试验

纯化培养后的细菌，无菌条件下用接种针刮取部分细菌小心均匀涂布到血琼脂平板，用镊子将药敏纸片紧贴到培养基上，两纸片中心距不少于25mm，纸片与边缘距不少于15mm。室温培养24h后测量抑菌圈大小，判定敏感度[9]。

表1 菌株采集和养殖场情况

2 结果

2.1 症状

长年均有发生，7～9月最为严重。病鱼主要表现为浮头、转圈、独游、蛙跃等，眼睛单侧或双侧突出、白浊，部分体色发黑，肛门红肿；解剖观察肝呈土黄或苍白色，胆、肾肿大，部分腹腔充水。

2.2 细菌分离和形态观察

大多数病鱼从脑、肝、肾接种24h后获得色泽一致，在划线位置形成细密排列的菌落。每个菌落圆形隆起，边缘光滑呈乳白色，直径0.5～2mm。革兰氏染色发现均为阳性球菌，单个或链状。

2.3 细菌药敏试验

本次试验分离菌株对26种常见抗生素包括奎诺酮类、磺胺类、酰胺醇类、头孢类等水产药物或其他医用药物的敏感性检测结果如表2所示，耐药率在60%以上的有复方新诺明、链霉素、新霉素、氟哌酸、多粘菌素B、依诺沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶（钠）、磺胺对甲氧嘧啶等药物，复方新诺明、磺胺对甲氧嘧啶表现为最高（90.9%）。而头孢类、恩诺沙星、盐酸沙拉沙星、复方磺胺嘧啶、氟苯尼考、青霉素等药物则检测有一定敏感的频率，敏感率最高为青霉素 G（36.4%）。从单个菌株来看，C4、C5对检测的26种药物有普遍的耐药程度，分别为92.3%和69.2%，耐药程度在40%以上的菌株，均来源于采集菌株一周前投喂过各种抗生素的养殖场。同一池塘不同时期采集的菌株，其药物敏感性试验结果也不同，在分别投喂恩诺沙星，阿莫西林后，分离菌株C7检测对26种药物的耐药率为46.2%，敏感率为0；停喂18天后分离菌株 C8检测对 26种药物的耐药率为 15.4%，敏感率为53.9%。

表2 分离菌株对药物敏感性的试验结果

3 讨论

罗非鱼链球菌病是一种暴发性流行病，近年报道罗非鱼链球菌感染的趋势明显增加，主要危害100g以上的幼鱼和成鱼，传染性强，发病率达10%～30%，死亡率达25%～80%[5]，病害的发生多与水温高、养殖密度大、水质差、投饲量大和饲料质量差有较大关系，严重危害罗非鱼养殖业的健康发展[10]。近几年年广西柳州地区罗非鱼链球菌病发生情况调查大致为：病害每年均有发生，水温长时间高于28℃，养殖密度高、投喂过多饲料时通常会发生暴发性死亡，死亡以个体大、长速快的罗非鱼居多。但调查发现了1例从海南引进3～4cm的苗种发生暴发性链球菌病急性死亡，说明链球菌病有向着感染幼鱼方向发展的趋势。

发生链球菌病后，养殖户首先采用的是传统防治方法，即使用各种水产抗生素药物如恩诺沙星、诺氟沙星、氟苯尼考、盐酸多西环素、复方磺胺二甲嘧啶粉等，但效果并不显著。通过本试验发现所有分离菌株均有一定程度的耐药性，养殖户选取的抗生素药物有极大的概率对病原菌不起作用，这可能是养殖户使用药物治疗无效的主要原因之一。试验完成后，我们将实验结果及时反馈给养殖户，并根据结果为养殖户用药提供指导。采用了敏感药物进行针对性治疗后，死亡率大大降低。例如养殖户在使用检测敏感率高的水产青霉素药物或其他有敏感性药物3-5d后，每日死亡量为1、2尾或无，效果非常明显。若出现链球菌病突然爆发，养殖户来不及送样进行药敏分析的情况，可以选择青霉素进行治疗，因为在试验药物中各菌株对青霉素的敏感率最高。此外，试验结果还发现，具有普遍耐药性的菌株，均来自长期、过量投喂单一药物，或者频繁换用药物的养殖场。因此，建议养殖户不要无目的的乱使用抗生素药物，而应在日常管理上通过注入地下井水、加深塘水、减少或不投喂饵料、适当分塘养殖、长时间增氧等方法来防治链球菌病，这样不但可以防止“超级细菌”的产生，同时也能避免抗生素残留带来的问题。

药敏试验虽然能为养殖户用药提供科学指导，但仍有一定的局限性，例如水产病原菌药敏试验没形成标准，抗菌药敏试剂少(如缺乏中草药药敏试剂缺乏等)，药敏试验周期长（3d），需要一定的实验室条件和操作技术。随着国内水产药敏试验的重视和标准化的逐步建立，其条件、方法、效率等方面不断改进，药敏试验将成为一种常规的水产养殖病害防治手段，普遍应用到现代化规模养殖中，科学指导和规范用药，确保我国水产品质量安全和水产养殖业健康发展。

[1] Perera R P, Johnson S K, Collins M D, et al. Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica × T. aurea hybrids[J].Aquat Anim Health,1994,6(4):335-340.

[2] Pasnik D J, Evans J J, Klesius P H. Duration of protective antibodies and correlation with survival in Nile tilapia(Oreochromis niloticus) following Streptococcus agalactiae vaccination[J]. Dis Aquat Org, 2005,66(2):129-134.

[3] 谭晶晶,陈昌福,高宇,等.奥尼罗非鱼无乳链球菌的鉴定、致病性及药物敏感性研究[J].华中农业大学学报,2010,29(6):745-751.

[4] 黎炯,叶星,卢迈新,等.双重PCR 快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌[J].湖南农业大学学报(自然科学版),2010,36(4):449-452.

[5] 张新艳,樊海平,钟全福,等.罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究[J].水产学报,2008,32(5):772-779.

[6] 柯剑,赵飞,罗理,等.广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性[J].广东海洋大学学报,2010,30(3):22- 27.

[7] 李波,陈明,李莉萍,等.广西罗非鱼链球菌病病原的生化鉴定及药敏试验[J].中国畜牧兽医,2008,35(10):93-95.

[8] 王辉,徐英春,陈民钧.简要介绍美国 NCCI.S药敏试验纸片扩散法法规(1993年 12月版)[J].中华医学检验杂志,1995,18(1):50-62.

[9] 张正,高屹,叶应妩. WS/T 125-1999中华人民共和国卫生行业标准,纸片法抗菌药物敏感试验标准[S].北京:中国标准出版社,2000.

[10] 卢迈新.罗非鱼链球菌病研究进展[J].南方水产,2010,6(1):75-79.