烷化剂EMS诱导剑麻愈伤组织突变方法研究

张燕梅，李俊峰，周文钊

(中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省热带作物营养重点实验室(筹)，广东 湛江524091)

剑麻为龙舌兰科龙舌兰属植物，主要分布在美洲、非洲、大洋洲等热带亚热带高温干旱的半荒漠地带［1］，其中墨西哥资源最丰富，被认为是龙舌兰麻的起源地［2］。我国龙舌兰科植物有7个属共41个种［3］，主要分布在广东、广西、福建、海南和云南等地［4］。近几十年，剑麻育种工作者不断从国外引进一些新的种质资源，也先后开展了剑麻杂交育种工作，并且获得了一些优良种质［3，5］，但剑麻种质资源严重缺乏的现象仍然存在。剑麻H.11648是由Lock等［6］从假菠萝麻与蓝剑麻杂交再与蓝剑麻回交后的杂交后代中筛选出来的，该品种具有叶片纤维含量高，年产叶片多，叶缘无刺且抗寒等特点，自1963年首次从坦喀尼喀引入我国［3］，经大面积试种成功后，目前已成为我国唯一当家品种，种植面积达98%以上［4］。由于该品种抗真菌能力较差［6］，病虫害不断滋生，严重影响了剑麻的高产稳产［7］，因此，开展剑麻遗传改良和种质创新尤为重要。

EMS为一种常用的化学诱变剂，自首次报道可有效诱导突变以来，已广泛应用于作物诱变育种。该方法操作简单方便，科学工作者们常利用EMS诱变处理，结合其它的方法，定向的筛选抗旱［8］、耐盐［9，10］、抗病［11，12］等新种质，已取得良好的进展。但有关剑麻EMS诱变等方面的研究还未见报道。本研究以剑麻愈伤组织为材料，开展剑麻EMS诱变研究，为剑麻种质资源创新奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

剑麻(Agave hybrid cv No.11648)来源于本实验室保存的无菌试管苗。化学诱变剂EMS(甲基磺酸乙酯)购自Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 愈伤组织的诱导

以剑麻无菌苗茎尖为材料，纵切后接种于愈伤组织诱导培养基上先进行暗培养1－2各个月，待愈伤组织诱导出后再置于半光条件下培养，愈伤组织诱导培养基为MS+6－BA 2.0 mg/l+NAA 0.2 mg/l+蔗糖 30 g/l+卡拉胶 7.5 g/l。培养条件为:温度26±2℃，光照12 h/d，光强1500 lux。每4周继代1次。

1.2.2 EMS 诱变处理

0.1 mol/l的磷酸缓冲液的配制和使用方法参照文献［13］，经高压灭菌后保存备用。以磷酸缓冲液为溶剂，分别配制浓度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 和1.0%的 EMS处理液，并以不加EMS的磷酸缓冲液为对照，分别处理2 h，4 h，6 h，8 h和16 h。取黄豆大小的淡黄绿色的块状或团状的愈伤组织于以上浓度的EMS处理液中进行EMS诱变处理，处理完后用无菌水漂洗3－5次，用滤纸吸干后接种于愈伤组织诱导培养基上培养2周，然后再转入不定芽分化培养基上进行培养。不定芽分化培养基为SH+6－BA 3.0 mg/l+NAA 0.2 mg/l+IBA 0.3 mg/l+蔗糖30 g/l+卡拉胶7.5 g/l，培养条件同上。

1.3 数据分析与处理

每个组合处理20块愈伤组织团块，处理3次，培养1个月后观察愈伤组织生长以及植株再生情况，并用SAS统计软件进行分析处理(不包括污染的)。致死率=死亡的愈伤组织块数/处理的愈伤组织总数×100%，不定芽分化率=(分化出不定芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织总数)×100%，分化系数=(所有分化出的不定芽总数/分化不定芽的愈伤组织数)×100%

2 结果与分析

2.1 EMS对剑麻愈伤组织生长的影响

EMS对剑麻愈伤组织生长的影响如表1所示:不同EMS浓度，相同处理时间内，随着EMS浓度的升高，愈伤组织生长受到明显抑制，愈伤组织死亡率增加。用0.2%和0.4%的EMS处理2 h时，愈伤组织生长良好，与对照无明显差异，当EMS浓度增加到0.8%时，愈伤组织死亡率为15.0%，EMS浓度为1.0%时，愈伤死亡率为30.8%。用0.6% －1.0%的EMS处理16 h，愈伤组织在1周内全部死亡。相同浓度，随着处理时间的延长，愈伤组织生长受到抑制，死亡率增加。在所试浓度范围内，处理4 h和6 h的愈伤组织生长与处理2 h的愈伤组织生长无明显差异，处理8 h则发生明显变化，愈伤组织生长受抑制，愈伤组织死亡率增加，用大于0.6%的EMS处理16 h时，除对照外，愈伤组织全部死亡。由此推断，低浓度短时间的EMS处理可促进愈伤组织的生长。高浓度或长时间处理抑制愈伤组织生长。用0.2%的EMS处理愈伤组织致死率比用0.4%和0.6%的EMS处理的致死率要高，可能与外植体的大小有关，在用0.2%的EMS进行处理时，有1/4的外植体的大小进行减半。这些较小的愈伤组织团块经EMS处理后多数死亡。用0.8%和1.0%的EMS分别处理6 h和4 h，愈伤致死率分别为52.22±1.11%和56.67±1.67%，超过“半致死”剂量，可以用作筛选剑麻EMS突变体的浓度组合(图1)。

表1 不同处理浓度和时间对剑麻愈伤组织生长的影响Tab.1 Effect of 30 treatments with six concentration levels and five time points on sisal callus growth

图1 愈伤组织在0.2%EMS处理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h和16 h后的生长情况A，B，C，D，E，F 分别为处理 0.2%EMS 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h 和 16 hFig.1 Callus growth treated with 0.2%EMS for 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h and 16 h respectively

2.2 EMS对剑麻不定芽发生的影响

如表2所示:对照处理的愈伤组织分化率均在95%以上，分化系数在28.83±2.72与24.00±5.56之间，即表明磷酸缓冲液对植株再生无影响。用0.2%的EMS处理2－4 h，分化系数均在27.00±5.56以上，与对照无明显差异，随着处理时间的延长，分化系数明显下降，处理16 h时分化系数仅有15.37 ±1.86，显著低于对照水平 24.00 ±5.56。用 0.4%、0.6%、0.8% 和 1.0% 的EMS进行处理，也获得相同的结果。相同处理时间，随着EMS浓度的增加，分化系数也明显下降。并且分析发现，分化系数与愈伤组织生长呈现正相关性，在相同处理组合内，愈伤组织生长越大越快，分化系数越高，可能与愈伤组织的活力有关。低浓度EMS有利于愈伤组织生长和分化系数升高，随着EMS浓度升高和处理时间延长，再生植株分化受到抑制。用0.8%和1.0%的EMS分别处理6 h和4 h，愈伤组织致死率超过“半致死”剂量，分化率分别为46.8%和41.7%，分化系数分别为7.63 ±1.10 和7.13 ±2.79(如图2)。

表2 不同处理时间和浓度对剑麻植株再生的影响Tab.1 Effect of 30 treatments with six concentration levels and five time points on sisal plant regeneration

图2 用0.8%和1.0%的EMS分别处理6 h和4 h获得的不定芽。左为0.8%处理6 h，右为1.0%处理4 hFig.2 Adventitious buds obtained from sisal callus treated with 0.8%and 1.0%EMS for 6 h and 4 h respectively

3 结论与讨论

3.1 低浓度的EMS有利于愈伤组织的生长

突变体是开展植物功能基因组研究的重要材料，目前已在拟南芥［14］，小麦［15］等多种植物中广泛应用，并在功能基因组学研究中发挥了重要的作用。本研究表明，低浓度的EMS有利于愈伤组织的生长和植株再生，这与朴铁夫［16］的研究结果一致。可能是低浓度的EMS刺激细胞使呼吸作用加强，并且可提高细胞色素氧化酶活性。詹亚光［17］研究结果也表明，0.1%的EMS可促进白桦愈伤组织生长，并且建议用该浓度的EMS来促进白桦愈伤组织的分化。

3.2 EMS的浓度与材料大小和状态有关

EMS诱变主要是功能基因的点突变，由于不同组织材料对EMS的敏感程度不同，所选材料将直接影响EMS的使用浓度和诱变频率。本研究过程中发现，用0.8%EMS处理绿豆大小的剑麻愈伤组织6 h，愈伤组织死亡率为52.22±1.11%，处理黄豆大小的愈伤组织6 h，愈伤组织死亡率仅为37.8%;分化系数也明显增加;另外继代次数越多，愈伤死亡率也越高，可能原因是愈伤团块越大，EMS只接触了表面的细胞和组织，对里面的细胞的损伤力度越小，在后续的培养中容易复苏，继代次数越多，细胞活力下降，有的愈伤组织会出现衰老死亡或分化，EMS的损伤会增加，死亡率也增加。对于剑麻愈伤组织继代时间以10－15 d为宜，这与罗静［11］的研究结果基本一致，黄俊生［18］则认为，对于菠萝而言，继代时间越长(5－30d)，对EMS的抵抗力也增强。詹亚光［17］在白桦的EMS诱变研究中建议将不同大小和继代时间的愈伤组织分开进行处理，鉴于此，在进行EMS诱变处理时，应针对不同的试验材料，选取合适的浓度组合。

4 结语

本研究获得了1，000多株剑麻EMS诱变植株并已成功移栽，表型观察发现有的植株生长明显比其它植株迅速，叶片较宽，染色体观察未发现染色体数目的改变(数据未列出)，建议作进一步的表型观察和细胞学分析，并且在以后的筛选工作中，最好能结合一些其他的方法，定向的筛选突变体，提高筛选效率，缩短育种周期。

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