红麻种质资源的聚类分析与DNA指纹图谱构建

2013-12-05刘倩陈基权戴志刚温岚龚友才粟建光

中国麻业科学 2013年2期

刘倩，陈基权，戴志刚，温岚，龚友才，粟建光

(中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙410205)

红麻(Hibiscus cannabinus L)为锦葵科木槿属一年生韧皮纤维植物，具有纤维产量高、耐旱、耐盐碱、易栽培等特性。红麻具有广泛的应用价值，纤维可用来生产麻袋、墙布、窗帘布等，秸秆可用来造纸、生产轻型板材、活性炭、汽车内衬等，被视为21世纪潜在的优势作物。红麻分布很广，遍及世界各地，中国、印度、泰国是世界红麻的主产国。迄今，我国已收集红麻种质资源1800多份，包括由国外引进品种、地方品种、育成品种、野生种、野生近缘种和育种中间材料及创新材料组成。科学准确地鉴定红麻品种及种质资源材料的遗传特性，对红麻遗传资源保护和利用、遗传资源评价、种子质量鉴定和品种权益保护具有重要意义［1］。郭安平等用16个RAPD引物对25份红麻及其近缘材料进行亲缘关系研究，多态性条带比率为77.6%，根据得到的DNA指纹图谱计算其Nei氏相似指数和遗传距离，并构建了系统树［2］。程舟等用AFLP分子标记技术对红麻种质资源遗传多样性进行了研究，实验结果支持了红麻起源于非洲的假设，并证实了栽培红麻首先被引到亚洲，并进一步被传播到中北美洲［3］。汪斌等对51份红麻种质资源进行耐寒性初步鉴定研究，鉴定筛选出7个耐寒性较强的红麻种质材料［4］。林荔辉等用13个ISSR引物对32份红麻种质资源进行亲缘关系研究，发现红麻多数栽培品种遗传基础狭窄［5］。陈美霞等利用SRAP、ISSR标记技术对红麻遗传连锁图的构建进行了初步研究［6］。祁伟等利用28个ISSR引物绘制出82个红麻品种的DNA指纹图谱，为红麻种质资源分子身份证的构建奠定了基础［7］。本研究选用来自不同国家和地区的48份红麻种质资源，利用SRAP分子标记对其进行遗传分析，绘制指纹图谱，为在分子水平上区分这些种质资源提供科学依据，为研究和利用这些种质资源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

从国家麻类种质资源中期库保存的红麻种质资源中选取48份(表1)，其中包括尼泊尔、美国、加纳、澳大利亚等17个国家引进和国内育成的34份栽培品种，8份野生种和6份近缘种。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

对供试材料的种子进行暗箱培养，取黄化苗的下胚轴按照改良CTAB法提取基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，纯化后保存在－20℃冰箱中。

1.2.2 PCR反应

以加纳红、911－4、ZB440、GA42、H192、ZM401的基因组 DNA 为模板，对225对 SPAP引物进行多态性筛选，SRAP引物均购自于上海生工生物技术有限公司(表2)。SRAP反应体系10mol，含有1mmol/L 10 ×PCR Buffer(含 Mg2+)，187.5μmol/L dNTP，1.25U Taq DNA 聚合酶，0.6μmol/L SRAP引物及10ng DNA模板。扩增反应程序为:94℃预变性5min;反应前5个热循环，每个热循环包括94℃变性1min，33℃退火1min，72℃延伸1min;随后的34个热循环复性温度提高到52℃，循环结束后72℃延伸5min，并在4℃下保存。

表2 SRAP引物序列Tab.2 Sequences of the SRAP primers

1.2.3 PCR反应产物的检测

用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶检测PCR扩增产物，电泳介质为1×TBE缓冲液，电泳后采用银染法染色，照相，记录试验结果。

1.3 数据处理和统计分析

对于48份红麻种质资源的SRAP扩增谱带，按照条带的分子量从大到小读取。同一位点扩增条带出现记“1”，不出现记“0”，将扩增谱带转化为数字指纹。根据SRAP扩增谱带结果，用NTSYS 2.1软件分析48份红麻种质资源之间的遗传相似系数，用类平均法(UPGMA)对其进行聚类分析并绘制系统树。

2 结果与分析

2.1 多态性引物对供试材料的SRAP分析

以加纳红、911－4、ZB440、GA42、H192、ZM401的基因组 DNA 为模板，对225对 SPAP引物进行多态性筛选，采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离SRAP的PCR扩增产物，共筛选出30对多态性好、条带清晰的SRAP引物，以这30对引物对48份红麻种质资源进行SRAP扩增，图1为引物组合ME1/EM9对48份红麻种质资源的扩增结果。30对SRAP引物扩增48份红麻种质资源，共获得284条谱带，平均每个引物扩增出9.47条谱带，其中多态性谱带268条，多态性条带比率为94.4%，表明供试的48份红麻种质资源遗传多样性比较丰富。

图1 引物组合ME1/EM9对48份红麻种质资源的扩增图谱Fig.1 SRAP patterns amplified by the primer combination ME1/EM9

2.2 特征谱带分析

筛选出的SRAP引物组合共扩增出8条特征带，可鉴别出8份材料(表3)，包括4个栽培品种、1个野生种和3个近缘种。由于具有特征条带的材料较少，因此要通过特征条带和多种引物组合结合的方法鉴别所有种质材料。

表3 SRAP标记扩增出的特征带Tab.3 Typical bands amplified with SRAP markers

2.3 聚类分析

基于SRAP扩增谱带，用UPGMA法对48份红麻种质资源进行聚类分析，遗传相似系数为0.60－0.93，以遗传相似系数0.74划分，48份红麻种质资源可以划分为四个类群(图2)。Ⅰ类群包括所有34个栽培品种和近缘种H182，说明H182与红麻栽培品种亲缘关系较近;Ⅱ类群包括所有供试野生种，ZB361和GA42亲缘关系最近，其次与ZB440亲缘关系较近，ZB361和ZB440均来自赞比亚，GA42来自加纳，说明亲缘关系与来源地关系不大。Ⅲ类群包括三个H.sabdariffa近缘种，玫瑰茄H196、H189、H192;Ⅳ类群包括两个H.acetosella近缘种，红叶槿H208和H118。

图2 127份红麻种质资源的UPGMA聚类图Fig.2 Dendrogram of cluster of 127 kenaf germplasm analyzed by UPGMA

2.4 指纹图谱构建

结合扩增产物多态性条带的数量和所能鉴别材料的数目两个方面考虑，选用M2/E10、M10/E9、M10/E3、M10/E1、M10/E2、M9/E3、M9/E7、M9/E5、M6/E3 这 9 对 SRAP 核心引物组合构建了48份红麻种质资源的指纹图谱(图3)，9对SRAP核心引物组合14条谱带就可以完全区分48份红麻种质资源。

3 讨论

本研究利用SRAP标记对48份红麻种质资源进行遗传分析并构建指纹图谱。相关扩增多态性(SRAP)是一种基于PCR的标记系统，是由美国加州大学蔬菜系Li与Quiros博士于2001年在芸薹属植物中开发出来的。由于SRAP标记是对基因组的重要组成部分开放阅读框(ORF)区域进行扩增，因此能够比较全面地揭示遗传种质资源的遗传特征，而且具有稳定性好、重复性高、无放射性污染等优点，已被广泛应用于遗传多样性分析和指纹图谱构建。

林荔辉等［5］等利用ISSR标记对来自20个国家的32份红麻种质资源进行了遗传多样性分析，遗传相似系数为0.62－0.90。郭安平等［2］用RAPD标记对25份红麻及其近缘种进行了遗传分析，遗传相似系数在0.79－0.98之间，表明其遗传基础都比较狭窄。本研究的供试材料遗传相似系数为0.60－0.93，表明材料间遗传关系较远，遗传基础较宽。48份红麻种质资源来源于不同国家和地区，不仅有从国外引进的遗传背景差异较大的材料，也有来自同一个育种单位遗传背景相近的材料，9对SRAP核心引物组合14条谱带就可以完全区分48份红麻种质资源，指纹图谱带型全部相同的概率为6.1×10－5，构建的指纹图谱适用于48份红麻种质资源的分类与鉴定。鉴定大范围的红麻种质资源群体时，可能会出现同一引物在不同品种中扩增出相同谱带的现象，对此，要结合不同分子标记和增加引物数等方法来区分不同品种。构建指纹图谱可以为红麻种质资源的鉴定、利用及红麻育种工作提供理论基础。