某猪场仔猪大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

鲁志平，庞 璞，杨晓玲，孙 霖，李云祝，吴显祥

（四川省大竹县动物疫病预防控制中心，四川 大竹 635100）

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌（Escherichia coli，简写E.coli）某些血清型引起的一种猪肠道传染性疾病，临床上分为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿病。随着规模化、集约化养猪业的发展，仔猪细菌性腹泻的发病率越来越高，危害也越来越严重。为了掌握四川大竹县仔猪大肠杆菌病的流行情况，笔者在辖区内某一养猪合作社的猪场采集了疑似仔猪黄、白痢的病料，并进行了病原分离鉴定及药敏试验等相关研究，为该猪场制定防控措施提供有益参考。现将有关结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料 选取大竹县某养猪合作社规模猪场疑似黄、白痢感染的腹泻仔猪，采用灭菌棉拭子从发病、濒死或死亡仔猪的直肠取样，共采集疑似病料20份，由大竹县动物疫病预防控制中心诊断室保存。

1.1.2 培养基及试剂 普通琼脂培养基、营养肉汤按文献制备；麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、糖发酵管、枸橼酸盐、MR试剂、VP试剂、靛基质等试剂，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.3 血清 E.coli O抗原单价血清，购自中国兽药监察所。

1.1.4 药敏片 成套药敏纸片，含30种抗生素，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离培养 将采集的病料分别划线接种于普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基上，37℃培养18～24h；然后挑取典型的单个菌落分别接种于普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、SS琼脂培养基、营养肉汤培养基进行纯菌增殖，观察菌落形态，再涂片，作革兰氏染色、镜检。

1.2.2 生化试验 将纯化菌株按肠杆菌科细菌生化鉴定要求分别接种于微量生化管内，37℃培养48～72h，观察并记录结果。

1.2.3 分离菌的血清型鉴定 将经形态特征及生化特性鉴定为E.coli的菌株接种于麦康凯培养基上，37℃培养24h；挑取纯培养物中的光滑菌落，接种于营养琼脂斜面，37℃培养24h；用2mL 0.5%的石炭酸生理盐水洗下琼脂斜面培养物，置小圆底试管中，制成菌悬液；121℃下高压灭菌2 h，破坏其荚膜抗原，制成高压抗原。用E.coli O抗原单价血清进行微量凝集试验，作血清型鉴定。同时以高压抗原和0.5%石炭酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝现象。

1.2.4 药敏试验 将分离鉴定后的E.coli纯培养物均匀地涂布于麦康凯琼脂培养基平板上，无菌条件下用灭菌镊子将药敏纸片平贴于培养基表面，要求纸片间距离≥24mm、纸片与培养皿边缘距离≥15mm，且每种药物需在不同位置贴2片，37℃倒置培养，分别于16h和24h观察并记录结果，用游标卡尺测量抑菌圈直径，并计算其平均值。

2 结果与分析

2.1 细菌分离及形态观察 经过37℃培养24 h后，分离菌纯培养物在普通琼脂培养基上生长为圆形、边缘整齐、表面光滑、半透明的小凸起菌落；在麦康凯琼脂培养基上生长为圆形、中等大小红色菌落，直径为1～2mm；在SS琼脂培养基上生长为中等大小、均匀红色、半透明、圆形、稍凸起的光滑菌落；在肉汤培养基中呈浑浊状态，管底有灰白色沉淀，液面管壁有菌环，伴有粪臭味。

分离菌经涂片，革兰氏染色、镜检，可观察到中等大小、无芽胞、单个或多个排列、形态较为一致、两端钝圆的革兰氏阴性球杆菌，疑似E.coli。

2.2 生化鉴定 根据《常见细菌系统鉴定手册》，该菌的16项生化鉴定结果均与E.coli相符，同时结合病症、菌落培养特性及菌体特性，确定该分离菌为E.coli。详见表1。

2.3 血清型鉴定 结果见表2。备检的E.coli通过定型，分属于 4 种血清型，优势血清型为 O20、O101、O141，基本代表了目前该养猪合作社猪场仔猪黄、白痢E.coli的主要流行血清型。

2.4 药物敏感性试验 分离E.coli菌株对复达欣（头孢他啶）、多粘霉素B高度敏感，对氨苄西林、哌拉西林、头孢呋辛、阿米卡星、新霉素等药物中度敏感，对其余17种药物表现为耐药或高度耐药。详见表3。

3 小结与讨论

3.1 随着集约化养猪业的发展，由致病性E.coli引起的仔猪腹泻严重威胁着仔猪的健康，死亡率相对较高，耐过仔猪大多成为“僵猪”，饲料报酬低；并且该病易与其他猪病混合感染，造成仔猪死亡率更高。因此，开展针对性的监测是目前集约化养猪生产中有效防控该病的重要手段。

表1 分离菌的生化鉴定结果

表2 E.coli O抗原血清型鉴定结果

表3 E.coli对30种抗菌药物的敏感性试验

3.2 通过对采集的疑似仔猪黄、白痢拭子病料进行病原分离、形态和培养特性观察及生化鉴定，证实该分离菌为典型的E.coli。说明该场仔猪在出生后所发生的腹泻主要是由致病性E.coli引起的。

3.3 从本次备检样品中分离出的致病性E.coli，有4种血清型，其中血清型O20、O101、O141所占比例较大，表明O20、O101、O141为优势血清型，代表了目前该养猪合作社猪场中仔猪黄、白痢E.coli的主要流行血清型。从全国各地区报道的血清型来看，各省市流行的猪源致病性E.coli O型血清型有较大差别，存在地区性、多样性，甚至同一地区的不同猪场，所流行的主要血清型也可能有所不同。此前，四川省其他市、区、县的规模化猪场中有关致病性E.coli O抗原血清型的鉴定及分布还鲜见报道。因此，定期对猪场的E.coli进行分离鉴定，明确当前流行的血清型，有利于开展针对性的免疫预防和临床诊治。

3.4 由于在养猪生产中滥用抗生素，造成目前E.coli的耐药谱和耐药水平不断提高，而且抗生素在畜体内残留对人类的健康也会产生不良影响。通过对分离E.coli进行耐药性试验，表明该场的E.coli耐药情况已较为严重，而且呈多重耐药。30种抗生素类药物中，只对复达欣、多粘霉素B高度敏感，而对氨苄西林、哌拉西林、头孢呋辛、阿米卡星、新霉素等药物中度敏感，对其余17种药物表现为耐药或高度耐药。所以在治疗过程中，应通过采用有效的药物和适当剂量来制定合理的治疗方案，做到“有的放矢”。

3.5 通过本试验研究，掌握了大竹县该养猪合作社仔猪腹泻的发病情况，并筛选出了有效的治疗药物，为制定科学的饲养管理模式，强化公共环境卫生安全等起到了积极的推动作用，也达到了提高猪场产仔成活率和仔猪育成率的目的。

参与文献：

[1] 刘梦元，吴 斌，刘建杰，等．规模化猪场大肠杆菌的耐药性监测及血清流行病学调查[J]．中国兽医学报，2004，24（1）：16-18．

[2] 赵晓静，高 婕，宋勤叶，等．保定地区仔猪大肠杆菌病的调查与对策分析[J]．中国动物检疫，2012，29（3）：45-46．

[3] 高月林，解志峰，等．黑龙江省东部地区腹泻仔猪大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验[J]．养殖技术顾问，2011，（11）：113．

[4] 陈天寿，等．微生物培养基的制造与应用[M]．北京：中国农业出版社，1995：257-260．

[5] 傅彩霞，郑瑞峰，郭 峰，等．北京部分地区仔猪大肠杆菌病血清型调查[J]．黑龙江畜牧兽医，2012，（3）：79-80．