188Re标记叶酸偶联白蛋白纳米微球对SKOV3人卵巢癌生长抑制作用研究*

唐秋莎 陈道桢 臧 嘉 郭彩琴

卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌[1]。目前，卵巢癌的治疗以手术为主，并联合化疗与放疗。晚期卵巢癌治疗后常易复发，一旦复发，治疗极为困难，5年存活率一般只能达到20%～30%[2]。所以，积极探索新的治疗药物和方法具有十分重要的意义[3-5]。本研究在前期工作基础上[6]，观察核素标记叶酸靶向白蛋白纳米微球(188Re-folate-CDDP/HAS MNP)对人卵巢癌细胞SKOV3体内生长的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器188Re-folate-CDDP/HAS MNP[7]、四氧化三铁纳米磁粒由本室自制[8]；小牛血清、McCOY’s 5A培养基、叶酸(Sigma)，注射用顺铂(山东齐鲁制药有限公司)，人血清白蛋白(上海生工生物科技有限公司)。188W/188Re发生器（上海科新公司），SPG-06A高频感应加热设备：频率230 kHz，功率4 kW，输出交变加热电流5～30 A（深圳双平高频加热器厂）。

1.2 实验动物 SPF级BALB/C裸鼠64只，雌性，4周龄，体质量18～22 g，购自中科院上海实验动物中心，许可证号：SCXK（沪）2002-0010。

1.3 方法

1.3.1 SKOV3人卵巢癌细胞培养 SKOV3人卵巢癌细胞接种于含10%小牛血清的McCOY’s 5A培养液中，在37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养，每2～3 d传代1次，实验时取对数生长期细胞。

1.3.2188Re-folate-CDDP/HAS MNP对SKOV3人卵巢癌细胞移植瘤生长的抑制作用 （1）裸鼠卵巢癌移植瘤模型的建立：将Balb/c nu/nu荷人SKOV3瘤株裸小鼠颈椎脱臼处死，浸入75%乙醇1 min，无菌条件下取出肿瘤，剥除表面纤维包膜，将肿瘤切为1 mm3的瘤块，浸入4℃生理盐水备用。Balb/c nu/nu裸小鼠乙醚麻醉后消毒右肩背皮肤，用12号注射针头穿破皮肤，将瘤块吸入14号上颌窦穿刺针通过皮下隧道种植在右肩胛部皮下，用络合碘棉球加压消毒穿刺处皮肤。待小鼠清醒后放入另一消毒饲养盒内。（2）建瘤成功的荷瘤鼠实验分组及治疗：接种瘤块7 d后，即可观察到肿瘤在小鼠皮下膨胀性生长，30～35 d后，移植瘤长径即可达0.5 cm左右。除去肿瘤生长过快和过慢的荷瘤鼠，将64只肿瘤长至0.5 cm的荷瘤鼠随机分为8组，每组8只。（A）阴性对照组：注入0.1 mL1640培养液。（B）单纯化疗组：folate-CDDP/HAS MNP，不加磁场。（C）单纯放疗组：188Re-folate-HAS MNP，不加磁场。（D）单纯热疗组：folate-HAS MNP，加磁场。（E）化疗联合放疗组：188Re-folate-CDDP/HAS MNP，不加磁场。（F）化疗联合热疗治疗组：folate-CDDP/HAS MNP，加磁场。(G)放疗联合热疗治疗组：188Re-folate-HAS MNP，加磁场。(H)热疗、化疗、放疗联合治疗组：0.1 mL188Re-folate-CDDP/HAS MNP,加磁场。白蛋白纳米球浓度为20 mg/kg，约含CDDP 3 mg/kg，放射性强度约为22.2 MBq。注射上述药物处理24 h后，将D、F、G、H4组移入交变磁场，0.5%的戊巴比妥钠溶液60 mg/kg腹腔注射，待完全麻醉后置高频感应加热器下照射（接种部位位于板式线圈中央）。经确认肿瘤中心与磁场中心重叠。在交变磁场下加热30 min。相同方法共热疗3次，间隔时间为48 h。治疗时测量治疗区和其周围区域的温度变化情况。（3）肿瘤质量抑制率：从热疗后的第2天开始观察各组荷瘤鼠及肿瘤的生长情况并分别予以记录和拍照，至治疗周期结束(6周)后，用脱臼法处死荷瘤鼠并剥离出肿瘤，用电子天平称瘤质量，依公式计算肿瘤质量抑制率（%）=(1-实验组肿瘤质量/对照组肿瘤质量)×100%。（4）大体形态及病理组织学观察：在治疗过程中观察各组肿瘤表面的皮肤改变，治疗结束后取出各组肿瘤，观察外观大小、颜色、形态，取各组全部肿瘤组织、心、肝、脾、肾、肺等，经4%中性甲醛固定、取材、脱水、透明、石蜡包埋、切片脱蜡、HE染色、封片，光镜下形态学观察。

1.4 统计学方法 用SPSS 13.0进行统计学分析。计量数据采用x±s表示，行t检验和单因素方差分析，以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤质量抑制率 各治疗组的肿瘤质量均低于对照组（Plt;0.05），热疗、化疗、放疗联合治疗组的肿瘤质量低于其他治疗组（Plt;0.05），见表1。

Table 1 Comparison of the quality and inhibitory rate of tumor between eight groups表1 各组肿瘤质量及抑制率比较

2.2 大体形态改变 在整个治疗过程中，热疗组肿瘤表面的皮肤时有出血、坏死及焦痂形成，有的焦痂可脱落，而对照组及未加热组少见此种改变；在治疗周期结束后，取出各组肿瘤组织发现加材料热疗组肿瘤均呈黑褐色及灰白色相间外观、病理证实为注入的纳米磁性粒子，对照组肿瘤呈灰白色、颜色较均匀一致；对照组肿瘤随着治疗时间的延长而逐渐增大，表面光滑，未见出血坏死，治疗组肿瘤在整个治疗周期中逐渐减小，部分表面凹凸不平，时有出血坏死。

2.3 病理组织学改变 光学显微镜组织学检查发现肿瘤组织为低分化癌；热疗、化疗、放疗联合治疗组部分肿瘤组织明显出血、坏死，其间可见黑色磁性纳米粒沉积，部分肿瘤组织正常，在二者交界处有炎症反应带及淋巴细胞浸润，而对照组肿瘤组织坏死较轻、炎症反应及淋巴细胞浸润也不明显，见图1、2。

3 讨论

近年来，以叶酸介导药物靶向肿瘤细胞的研究逐渐成为热点[9]。本文采用包裹化疗药物(顺铂)、磁粒的白蛋白纳米微球，并在其表面偶联叶酸及标记放射性核素188Re[7]，利用叶酸受体在肿瘤细胞表面高表达的特点[10]，对肿瘤细胞实现靶向性的热疗、化疗、放疗三重杀伤作用。

在体内治疗实验中，首先需制备移植瘤模型。由于卵巢癌的生理特点，未见卵巢癌原位动物模型的报道，故本文采用在小鼠腋下接种SKOV3肿瘤细胞的异位移植瘤模型。在SKOV3建立异位卵巢癌的过程中发现，SKOV3细胞直接接种于裸鼠皮下潜伏期长，约7 d左右可见开始生长，25 d后生长较快，但长势不太均匀。故本实验先将SKOV3细胞于裸鼠皮下接种，待瘤块长至合适大小后，超净台上无菌环境下，处死裸鼠，剥取瘤块，分割成大小均匀的小块，再用穿刺针穿刺注入裸鼠皮下，10 d以后，可见肿瘤长势良好。这样可减少组间肿瘤本身大小差异对药效评价的影响。

近年来，肿瘤综合治疗的研究发展迅速，大量体内及体外实验均证明热疗联合放疗、化疗可以明显增强彼此的治疗效果。热疗可以抑制多重耐药菌（MDR）1和多重耐药相关基金(MRP)的表达从而对抗多药耐药性，增强细胞内药物浓度[11]。热疗还可以大大增强癌细胞对放疗的敏感性[12]，从而诱导细胞凋亡。但在联合治疗方式中，往往化疗药物和热量缺乏靶向性，技术方面也很难达到控温和恒温的要求，本实验以白蛋白磁性纳米微球为载体，以叶酸受体为作用靶点，将化疗、热疗、核素放疗三者有机结合起来。特异性方面，利用叶酸受体配体高亲合性的生物靶向性，以保证治疗安全性[13]；在治疗作用方面，结合化疗及核辐射的定向杀伤作用和磁感应升温的物理治疗，以达到治疗的有效性[14]，磁感应加热的模式也在一定程度达到了控温和恒温的要求。本研究结果表明，各治疗组的肿瘤质量均低于对照组，且与其他治疗组相比，热疗、化疗、放疗联合治疗组对细胞增殖的抑制作用最为显著。

本研究组织学检查发现许多均一性棕黄色的磁性纳米粒聚集在肿瘤周边的基质中，该材料沉积部位附近多数肿瘤细胞消失，并且在材料周围可见坏死区域。然而热疗过程中不可避免的技术难题是使肿瘤组织均匀升温达到所需的温度而不损伤肿瘤周围正常组织。为了解决该难题，本研究采用了按顺时针3、6、9、12点多点注射的方法将纳米粒注入肿瘤瘤体内。结果显示该方法对肿瘤周围正常组织损伤小、升温均匀、材料具有很好的弥散性。

Figure 1 Results of hematoxylin and eosin staining in transplanting human ovarian cancer after treatment with combined therapy of hyperthermia,chemotherapy and radiotherapy(×400)图1 热疗、化疗、放疗联合治疗组移植性卵巢癌HE染色图(×400)

Figure 2 Results of hematoxylin and eosin staining in transplanting human ovarian cancer of negative control group(×400)图2 对照组裸鼠卵巢癌移植瘤HE染色图(×400)

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