1,25-二羟基维生素D3抑制脂肪细胞分化作用的研究*

关晓慧 王 君 郭 菲 周 杰 王宝利

骨髓间充质干细胞是骨髓中除了造血干细胞之外的另一类干细胞，具有定向或多向分化的潜能，在特定的诱导条件下可以向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞及神经细胞等组织细胞分化。正常生理状态下，间充质干细胞具有向脂肪细胞和成骨细胞相等的分化潜能。在某些病理状态下，成骨或成脂的某一方面调控占优势，通常会削弱间充质干细胞向另一方向分化的能力，存在着此消彼长的关系[1-2]。1,25-二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]是体内主要的钙磷调节激素，其可通过调节肠道和肾脏对钙磷的吸收和重吸收、骨钙的转移来调控矿物质的生理平衡，促进骨的矿化和生长[3]。此外，生理剂量的1,25(OH)2D3可抑制成骨细胞增殖、促进成骨细胞分化[4-5]。本研究观察了1,25(OH)2D3对脂肪细胞分化的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 间充质干细胞系C3H10T1/2由本室保存。1,25(OH)2D3、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤（IBMX）、地塞米松和胰岛素购自Sigma；胎牛血清、BME、胰酶、α-MEM等为Invitrogen公司产品；RNA提取试剂盒、蛋白提取试剂盒为天根公司产品；β连环素（β-catenin）抗体购自Epitomics公司；引物由上海Invit⁃rogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 前脂肪细胞C3H10T1/2的培养与分化 在37℃、5%CO2的条件下，用含10%FBS和100 U/mL青霉素、链霉素的BME培养基培养间充质干细胞系C3H10T1/2。当细胞达到80%汇合时，将细胞接种于6孔板中，待细胞汇合1 d后，加入含有0.5 mmol/L IBMX、10-7mol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素和10%FBS的α-MEM培养基培养72 h后，再换以含10 mg/L胰岛素、10%FBS的α-MEM培养48 h。

1.2.2 细胞的分组与处理 C3H10T1/2细胞分为6组（每组4孔），分别为对照组、诱导分化组和4个不同剂量(依次为10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)的1,25(OH)2D3处理组（依次命名为VD3处理组1～4）。其中对照组加入溶媒，诱导分化组加入脂肪细胞诱导分化试剂进行诱导分化（如1.2.1所述），1,25(OH)2D3处理组除了加入脂肪细胞诱导分化试剂外，分别予以10-9、10-8、10-7、10-6mol/L 1,25(OH)2D3处理。

1.2.3 油红O染色以及细胞计数观察脂肪细胞的分化情况 将诱导5 d的细胞用PBS洗涤后，依次用4%多聚甲醛固定15 min；蒸馏水漂洗1 min；60%异丙醇孵育1～2 min；油红O染色5 min；蒸馏水漂洗干净。显微镜下观察各组脂肪细胞的分化情况，拍照并计数；然后计算成脂率（脂肪细胞数/总细胞数）及RF（处理组成脂率/对照组成脂率），分析脂肪细胞的分化情况。

1.2.4 RT-PCR检测脂肪细胞特异性转录因子和表征基因表达 细胞总RNA提取按照天根总RNA提取试剂盒说明书进行。采用Thermo逆转录试剂盒将2 μg RNA合成为cDNA第1链。运用primer 5软件设计脂肪细胞特异性转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ、CCAAT增强子结合蛋白（C/EBP）α、脂肪细胞表征因子aP2以及Wnt/β-catenin信号通路抑制因子分泌性卷曲相关蛋白1（sFRP1）的引物，引物序列见表1。RT-PCR反应体系：cDNA 3 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Sybr Green PCR Master Mix 10 μL，去离子水补充至20 μL。反应条件：95℃2 min预变性，95℃变性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸20 s，共进行40个循环。采用融解曲线法分析PCR产物，以排除引物二聚体的干扰。采用2-∆∆Ct法计算各实验组目的基因相对于对照组的表达量，其中∆Ct=目的基因Ct值-β-actin Ct值。

1.2.5 Western blot检测β-catenin蛋白表达 消化收集细胞，加入适量蛋白裂解液，冰上放置20 min，10 000×g离心15 min，取上清，用BCA方法测定蛋白浓度。分别取各组蛋白30 μg进行10%SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到NC膜上，脱脂奶粉封闭2 h，与一抗孵育过夜，TBST洗涤4次，每次10 min后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，TBST洗涤4次，每次10 min后，采用ECL化学发光试剂盒检测印迹结果。

Table 1 Primer sequence of genes表1 各基因引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 1,25(OH)2D3对脂肪细胞分化的影响 对照组前脂肪细胞只有6.00%分化成脂肪细胞，诱导分化组可见80.15%的细胞分化成脂肪细胞；1,25(OH)2D3处理后，分化的脂肪细胞显著减少（均Plt;0.01），并呈现剂量依赖关系，见表2。

Table 2 Comparison of adipocyte differentiation between different treated cells表2 各组细胞中脂肪细胞分化率的比较（n=6，x±s）

2.2 RT-PCR检测目的基因表达 与对照组比较，诱导分化组脂肪细胞特异性转录因子PPARγ、C/EBPα及脂肪细胞表征因子aP2的mRNA表达显著增加，分别达到对照组的11.69倍、11.44倍和28.18倍，Wnt/βcatenin信号通路抑制因子sFRP1 mRNA亦显著增加，达到对照组的4.52倍（均Plt;0.01）。1,25(OH)2D3处理后PPARγ、C/EBPα、aP2和sFRP1mRNA表达显著减少，并呈现剂量依赖关系，见表3。

Table 3 Relative expression levels of PPARγ,C/EBPα,aP2 and sFRP1 mRNA in different groups of cells表3 各组细胞中PPARγ、C/EBPα、aP2和sFRP1 mRNA相对表达情况 （n=6，x±s）

2.3 Western blot检测β-catenin蛋白的表达 对照组、诱导分化组、1,25(OH)2D3处理组（10-6mol/L组）中β-catenin/β-actin比值依次为0.98±0.07、0.48±0.04、0.83±0.03，差异有统计学意义（F=87.61，Plt;0.01）。与对照组比较，诱导分化组β-catenin蛋白表达水平显著下降（Plt;0.01）；1,25(OH)2D3处理后，β-catenin蛋白表达水平显著升高（Plt;0.01），见图1。

Figure 1 Effects of 1,25(OH)2D3on β-catenin protein expression in C3H10T1/2图1 1,25(OH)2D3对C3H10T1/2中β-catenin蛋白表达的影响

3 讨论

脂肪细胞和成骨细胞来源于相同的祖细胞-间充质干细胞，因而脂肪细胞和成骨细胞分化之间存在着此消彼长的关系。骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中C/EBPs和PPARγ等转录因子起了关键性作用，其中PPARγ的作用尤为显著[6]。C/EBPs家族属于脂肪细胞特异性转录因子，包括α、β、δ3种异构体，它们分别在脂肪细胞分化的不同时期表达[7]。其中，C/EBP β和 C/EBP δ在前脂肪细胞分化早期表达较高，可以诱导C/EBPα和PPARγ的表达（PPARγ和C/EBPα的启动子上均含有C/EBP的结合位点），到分化晚期C/EBP β表达降低而C/EBP δ几乎不表达，C/EBP α在分化晚期开始表达，它可以转录激活许多脂肪细胞特异性基因如aP2，从而进一步促进前脂肪细胞的分化。PPARγ是一类由配体激活的脂肪细胞特异性核转录因子，属于Ⅱ型核激素受体超家族，在决定细胞命运、脂类物质生物合成、炎症和胰岛素敏感性等方面有重要功能[8]。间充质细胞中PPARγ被激活后可以抑制Runx2和Osterix等成骨细胞特异性转录因子表达，因而成骨细胞分化减弱而脂肪细胞分化加强。相反，PPARγ2基因失活突变也可以打破骨髓间充质细胞成骨/成脂分化的平衡，造成脂肪细胞分化障碍而成骨细胞分化增强，小梁骨量增加[9]。

1,25(OH)2D3是维生素D在体内的最终活性成分，其在调控骨形成以及骨发育中起重要作用。Boyan等[4]研究发现1,25(OH)2D3处理成骨细胞分化时，成骨细胞特异性转录因子Runx2、Osterix等表达增加，成骨细胞分化增强。与此同时，成骨细胞的增殖受到抑制。

本研究中，受脂肪细胞诱导分化试剂的影响，间充质细胞中PPARγ和C/EBPα表达量急剧增加，脂肪细胞表征因子aP2也显著升高。1,25(OH)2D3处理后PPARγ、C/EBPα及aP2的mRNA表达显著减少。与此一致，在脂肪细胞诱导分化试剂的作用下，间充质细胞分化为具有大量脂肪滴的脂肪细胞，而1,25(OH)2D3的处理强烈阻断脂肪细胞的生成。

经典Wnt通路通过上调成骨分化相关基因Runx2、DIx5或Osterix促进骨髓间充质干细胞发育为成骨细胞，而成脂细胞的活化需要经典的Wnt信号通路的失活[10-11]。本研究中1,25(OH)2D3下调C3H10T1/2细胞中sFRP1 mRNA的表达，而β-catenin蛋白表达水平明显升高，表明1,25(OH)2D3可能通过下调sFRP1基因表达，继而激活β-catenin信号通路，从而阻断脂肪细胞分化。

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