左乙拉西坦片在健康人体内的生物等效性研究

何小爱，刘智，朱刚直（1.海口市人民医院暨中南大学湘雅医学院附属海口医院，海口57008；.湖南泰格湘雅药物研究有限公司，长沙 41000）

左乙拉西坦（Levetiracetam）为吡拉西坦的类似物，是一种新型抗癫痫药，用于成人及4岁以上儿童癫痫患者部分性发作的添加治疗。与传统的抗癫痫药相比，左乙拉西坦作为添加治疗对于儿童各型癫痫均有疗效，尤其对于复杂局限性发作、肌阵挛发作等具有较好的治疗效果，且不良反应轻，是一种安全性好、疗效佳的抗癫痫新药；对于成人耐药性癫痫部分性发作治疗亦有效，且不良反应轻，对耐药性癫痫患者是一种有益的选择。本试验对2个不同厂家生产的左乙拉西坦片进行人体相对生物利用度测定，从而作出生物等效性评价。

1 材料

1.1 仪器

1200型高效液相色谱仪，包括在线脱气机、自动进样器、四元泵、柱温箱、紫外检测器及Chemstation化学工作站（美国安捷伦公司）；AB135-S十万分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；TGL16 M型冷冻离心机（长沙英泰仪器有限公司）；AHL-2001-P型实验室纯水系统（重庆颐洋企业发展有限公司）。

1.2 药品与试剂

受试制剂：左乙拉西坦片（天津泰普药品科技发展有限公司，规格：每片250 mg，批号：20110304）；参比制剂：左乙拉西坦片（UCB Pharma S.A，规格：每片250 mg，批号：31745）；左乙拉西坦对照品（天津药物研究院药业有限责任公司，含量：99.87%，批号：101201）；内标：戊巴比妥钠对照品（北京化学试剂公司，批号：061206）；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate LP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保护柱：Ultimate LP-C18（10 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.6%磷酸水溶液-乙腈[梯度洗脱程序：0～8.45 min，84∶16（V/V）]；8.45～8.5 min，由84∶16（V/V）均匀变换到10∶90（V/V）；8.5～9.45 min，10∶90（V/V）；9.45～9.5 min，由10∶90（V/V）均匀变换到84∶16（V/V）；流速：1 ml/min；柱温：40℃；进样量：20 μl；检测波长：210 nm。

2.2 溶液的配制

2.2.1 左乙拉西坦贮备液：准确称取左乙拉西坦对照品10 mg，置于10 ml量瓶中，以少量水溶解后，加水至刻度线，摇匀，即得含左乙拉西坦浓度为1 g/L的贮备液，置于4℃冰箱保存。

2.2.2 内标溶液：准密称取戊巴比妥钠对照品10 mg，置于10 ml量瓶中，用少量水溶解后，加水至刻度，摇匀，即得浓度为1 g/L的内标戊巴比妥钠贮备液，置于4℃冰箱保存。临用前将内标贮备液用水稀释成浓度为500µg/L的内标戊巴比妥钠工作溶液。

2.3 血样预处理

精密移取200 μl血浆样本于10 ml玻璃离心试管中，加入内标溶液（500 μg/ml戊巴比妥钠）50 μl，涡旋混匀30 s，加入乙酸乙酯3 ml，涡旋3 min，450 g离心力离心5 min，吸取上清液2.5 ml至另一洁净玻璃试管中，40℃氮气流下吹干，100 μl纯水复溶，进样20 μl到色谱系统分析。

2.4 方法学验证

2.4.1 系统适用性：配制含左乙拉西坦0.3125 μg/ml的血浆样本1份，按照“2.3”项下方法处理后进样分析5次，分别记录待测物与内标的色谱峰面积值，并计算待测物与内标的色谱峰面积比值，考察其精密度。结果表明，每个分析批的5次重复分析的RSD均＜10%，满足生物样本测试方法要求。

2.4.2 特异性：选取6份不同来源的健康受试者空白血浆，按照“2.3”项下操作处理（不加内标），进样分析得到空白血浆样本色谱图，其典型色谱图见图1 A；选取6份不同来源的健康受试者空白血浆，配成含左乙拉西坦质量浓度为0.3125 μg/ml的血浆样本，按照“2.3”项下操作处理，进样分析得到加样血浆样本色谱图，其典型色谱图见图1 B；取健康受试者用药物后0.5 h的血浆样本，按照“2.3”项下操作处理，进样分析得到受试者使用药物后的代表性血浆样本色谱图，其典型色谱图见图1 C。结果表明，左乙拉西坦和内标戊巴比妥钠保留时间分别为5.4 min和10.6 min左右，血浆中内源性物质不干扰左乙拉西坦和内标戊巴比妥钠的测定。

图1 典型色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+0.3125 μg/ml左乙拉西坦对照品溶液；C.口服左乙拉西坦片500 mg后0.5 h血浆样品Fig 1 Typical chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+0.3125 μg/ml levetiracetam control；C.plasma sample 0.5h after a single oral dose of Levetiracetam tablets 500 mg

2.4.3 标准曲线和最低定量限：配制含左乙拉西坦40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/ml的8个不同质量浓度级别的系列标准血浆样本，按照“2.3”项下操作后处理进样分析，记录色谱。以左乙拉西坦和内标戊巴比妥钠峰面积比值（y）作为纵坐标、左乙拉西坦浓度（x）为横坐标进行回归分析，得标准曲线方程y＝0.2498 x－0.0001（r＝0.9997），权重二次曲线（响应值）。结果表明，左乙拉西坦血药浓度在0.3125～40 μg/ml范围内线性关系良好。最低定量限为0.3125 μg/ml。

2.4.4 绝对回收率试验：配制含左乙拉西坦0.625、5.0、32.0 μg/ml的血浆样本各5份，按照“2.3”项下操作处理后进样到色谱系统分析，分别得到血浆样本中左乙拉西坦的峰面积A1；另取含左乙拉西坦6.25、50.00、320.00 μg/ml的对照品溶液各20 μl，加入50 μl内标工作液和30 μl纯水，混匀后进样到色谱系统分析，各浓度平行5份。分别得到左乙拉西坦的色谱峰面积A2。绝对回收率计算公式为3/2.5×A1/A2×100%，结果见表1。

表1 精密度及回收率试验结果Tab 1 Results of precision and recovery tests

2.4.5 精密度与回收率试验：配制含左乙拉西坦0.625、5.0、32.0 μg/ml的血浆样品各5份，按照“2.3”项下方法操作，进样分析，以当日的标准曲线计算左乙拉西坦浓度。连续3 d做3批次，考察左乙拉西坦测定方法的精密度和准确度。精密度和方法回收率结果见表1。

2.4.6 稳定性试验：配制含左乙拉西坦0.625、5.0、32.0μg/ml的血浆样本，平行各4份。1份配制好后按“2.3”项下方法操作后，立即进样分析；1份血样室温放置4 h后提取操作；1份冷冻保存60 d后取出，解冻后提取操作；1份反复冻融3次后提取操作。结果显示，所有稳定性考察试验测定值与添加值的相对偏差（RE）均＜15%，说明分析测试过程中的样本较为稳定。

2.5 受试者选择

选择20名健康男性志愿者，年龄为（22.2±2.1）岁，体质量为（65.4±6.1）kg，身高为（173.1±4.3）cm，无烟、酒嗜好。试验前经询问病史、体格检查和实验室检查均未发现异常；受试者无药物过敏史和药物依赖史，无精神病史以及其他慢性病史；2周内未使用任何药物；试验期间统一清淡饮食；签署知情同意书。试验方案经中南大学湘雅三医院伦理委员会批准。

2.6 给药方法

采用随机、开放、两制剂、两周期、交叉试验设计，将20名健康男性受试者随机分为2组，每组10人。于试验前一日20：00开始禁食，禁食12 h后，试验当日8：00空腹给药，每名受试者用200 ml温水送服左乙拉西坦片500 mg，服药2 h后进水，4 h后统一进标准餐。洗脱期7 d，交叉重复上述试验。

2.7 血样采集

分别于给药前（0 h）及给药后0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、9.0、12.0、24.0、36.0 h时抽取肘静脉血5 ml，于3000 r/min离心5 min，分离血浆，－20℃保存待测。

2.8 数据处理及统计分析

使用WinNonlin 6.0软件，采用非房室参数求算方法（NCA模块），对左乙拉西坦的人体药动学参数进行求算。采用SPSS 13.0软件进行统计分析。

3 结果

3.1 相对生物利用度试验结果

20名健康受试者随机交叉单剂量口服左乙拉西坦受试制剂或参比制剂500 mg后，其平均药-时曲线见图2；主要药动学参数见表2。

图2 健康志愿者单剂量口服2种左乙拉西坦片500mg后的平均药-时曲线（n＝20）Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of levetiracetam in healthy volunteers after a single oral dose of 500mg Levetiracetam tablet（n＝20）

3.2 生物等效性评价

受试制剂和参比制剂中左乙拉西坦的AUC0-36h、AUC0-∞及cmax经对数转换后，进行方差分析，方差分析及Mann-WhitneyU检验均以P＜0.05为组间的差异有统计学意义。结果表明，AUC0-36h、AUC0-∞和cmax在不同周期间及不同制剂间差异均无统计学意义，双单侧t检验结果表明AUC0-t、cmax值的统计参数th和tl均＞单侧t（0.05，18）（1.734）。受试制剂和参比制剂tmax值经Mann-Whitney非参数检验，结果表明tmax在不同制剂间差异均无统计学意义。受试制剂对参比制剂的相对生物利用度（F）为（102.0±7.8）%。双单侧t检验计算所得的受试制剂AUC0-36h、AUC0-∞及cmax的90%可信区间分别为97.9%～104.1%、98.6%～105.0%和98.0%～116.0%，把握度（Power）均＞0.8。其中cmax落在参比制剂cmax的75%～133%的范围内，AUC0-36h、AUC0-∞落在参比制剂AUC的80%～125%的范围内。根据以上结果判定，受试制剂与参比制剂具有生物等效性。

表2 健康志愿者单剂量口服2种左乙拉西坦片500mg的主要药动学参数（n＝20）Tab 2 Main pharmacokinetics parameters of levetiracetam in healthy volunteers after single oral dose of 500mg Levetiracetam tablet（n＝20）

4 讨论

本研究分析测试方法灵敏度和准确度高、专属性强、重现性好，经方法学考察确证其相对回收率和日内、日间精密度均符合生物样品测定的要求，适用于血浆中左乙拉西坦质量浓度测定及其药动学研究。在本文中，2种左乙拉西坦片的主要药动学参数不存在显著性差异，且与文献报道基本一致[1-5]，表明2种制剂在体内的药动学过程基本一致。受试制剂的相对生物利用度为（102.0±7.8）%，2种制剂具有生物等效性。

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