减毒沙门氏菌为载体在HepG-2细胞中表达EGFP基因

刘立明

（吉林农业科技学院，吉林吉林 132101）

传统的基因疫苗载体主要为病毒载体，其转移率较高，稳定性强，但是靶向性不强，存在安全风险、容量限制以及局部用药极不方便等问题。理想的肿瘤治疗基因载体应具有良好的靶向性，减毒沙门氏菌就具有良好的嗜肿瘤特性。沙门氏菌（salmonella）是一种胞内寄生的兼性厌氧菌，突破肠道屏障的沙门氏菌被吞噬细胞吞噬后，被运送至相关粘膜及全身淋巴组织，通过血液循环，定居在肝、脾及肿瘤组织。本研究以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因为目的基因构建真核表达载体转化减毒鼠伤寒沙门氏菌，在体外对其机制进行研究，为进行各种目的基因的导入研究其在肿瘤基因治疗中的作用，为进一步阐明其靶向性机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

脂质体 Lipofectamine，PVAX-EGFP质粒为本实验室保存，Xho I与BamH I购自 Invitrogen公司，RPMI 1640 培养液、牛血清购自Gibco 公司，人肝癌细胞HepG-2购自中科院上海生命研究院。荧光显微镜及成像系统为日本Olymps产品。

1.2 PVAX-EGFP质粒电转化Ty21

无菌操作取1.5μL（5pg-0.5μg）PVAX-EGFP质粒加入到装有新鲜制备的沙门氏菌感受态细胞的小管中混匀；将混合物转移至电极杯中，放入样品槽；将电转仪电压调到1.5kV，电击后取出电极杯，立刻加入1 ml LB培养液，混匀转移至无菌培养管中，37℃中振荡培养40min，涂布于含有AmpLB平板上。

1.3 重组沙门氏菌中质粒的鉴定

挑去单菌落接种于含有Amp的LB培养基中培养过夜，从沙门氏菌中抽提质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，抽提的质粒进行Xho I与BamH I双酶切，将鉴定含有PVAX-EGFP的沙门氏菌命名为Ty21/PVAX-EGFP。

1.4 含PVAX-EGFP沙门氏菌转染HepG-2细胞

在6孔细胞培养板中接种1×105个HepG-2细胞，营养液为1640（含5%胎牛血清），5%CO2培养箱37℃培养18～24 h至40～60%的细胞融合度，转染前，用0.01 mol/L PBS（pH7.4）洗涤细胞1次；5 000 rpm离心收集菌体，用0.01 mol/L PBS 重悬；用Ty21/PVAX-EGFP 重组菌感染细胞（数量为10∶1）20 min；用0.01 mol/L PBS（pH7.4）洗涤细胞3 次，再用含100 mg/L 青链霉素的1640 培养液培养2 h；换用含10 mg/L 青链霉素的1640（含2 %胎牛血清）继续培养48～96 h，在荧光倒置显微镜下观察EGFP在细胞的表达。

1.5 Western blotting 检测细胞中EGFP

收集转染时间为72 h 的HepG-2细胞，用胰酶消化，反复冻融5 次，4℃，8 000 r/min 离心5 min，收集上清液，加入等量上样缓冲液，煮沸5 min，冰浴2 min，- 20℃备用。细胞裂解物经SDSPAGE 电泳分离后，转移至硝酸纤维素（NC）膜，用5 %脱脂奶PBS 封闭液封闭2 h，用0.5 %吐温-20 的PBST洗涤3 次（每次10 min），加入适量用封闭液稀释的鼠抗EGFP血清，37℃作用1.5 h后，再用PBST洗涤3 次（10 min/次），加入作适当稀释的羊抗鼠IgG-HRP 1 h，用PBST 洗膜3次（10 min/次）后，显色。

2 结果

2.1 沙门氏菌中重组质粒的鉴定

质粒进行Xho I与BamH I双酶切后，出现约780bp的目的条带，详见图1：

图1 沙门氏菌重组质料图谱

2.2 荧光检测

培养48～96 h，在荧光倒置显微镜下可见EGFP在细胞中表达，详见图2。

图2 沙门氏菌荧光图谱

2.3 EGFP基因在细胞中的表达

经western blot 鉴定后在27ku处有1条特异的印迹带，详见图3。

图3 沙门氏菌印迹带

3 讨论

沙门氏菌是是1种侵袭性胞内菌，它与宿主之间的反应通过Ⅲ型分泌机制介导，这种机制使细菌的效应蛋白能直接转移到真核细胞发挥作用，使其可以传递表达效应基因并同时表达多种治疗性蛋白，为沙门氏菌用作肿瘤基因治疗的靶向载体提供了可能。而近年来迅速发展的基因工程技术能将沙门氏菌的致病基因敲除后得到减毒菌株，为安全性提供了保证。国外将减毒鼠伤寒沙门氏菌独立或作为基因载体治疗小鼠黑色素瘤等恶性肿瘤多有报道，效果良好。国内亦有人将减毒鼠伤寒沙门氏菌（SL3261）作为口服基因治疗载体治疗小鼠乳腺癌和肺癌，取得一定效果。

本研究将PVAX-EGFP利用电转化方式成功转入沙门氏菌中，经荧光倒置显微镜观察、western blot鉴定，证实了以减毒沙门氏菌为载体传递PVAX-EGFP能够在HepG-2细胞内得到表达，为以减毒沙门氏菌Ty21做为运转载体构建新型抗肿瘤疫苗奠定了基础。

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