WZ系列T790M EGFR抑制剂强效抗肿瘤功效的内在机制探讨

雷 凯，刘祥均，陈俐娟，杨明理，向明礼

(四川大学 华西医院生物治疗国家重点实验室，成都 610041)

刘祥均(1988- )，男(汉族)，山东济宁人，在读硕士研究生，研究方向：药物合成与分子模拟。

WZ系列T790MEGFR抑制剂强效抗肿瘤功效的内在机制探讨

雷 凯，刘祥均，陈俐娟，杨明理，向明礼

(四川大学 华西医院生物治疗国家重点实验室，成都 610041)

为深究WZ系列抑制剂强效抑制突变型表皮生长因子受体(T790MEGFR)的内在机制，用密度泛函理论(DFT)在B3LYP/6-31G(d)计算水平上对进入临床试验阶段的T790MEGFR不可逆抑制剂HKI-272及WZ系列抑制剂进行了研究。结果表明，WZ系列抑制剂在参与Michael加成反应的能力、与T790MEGFR形成的氢键的强度等方面，都优于HKI-272。抑制剂中的参与形成氢键的氢键供体N原子所带的NBO电荷与抑制剂的抗肿瘤功效高度相关。

表皮生长因子受体；不可逆抑制剂；T790M突变；密度泛函理论

表皮生长因子受体(EGFR)是人表皮生长因子受体家族中的一员。该家族由4个不同的受体酪氨酸激酶组成。这些结构类似的成员分别是EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4。作为跨膜受体，EGFR由胞外配体结合区、跨膜区和胞内激酶区三部分构成。在与表皮生长因子EGF结合后，EGFR被激活，继而发生自身磷酸化作用、引发下游信号[1]，从而调节细胞的存活、增殖、转移和凋亡等一系列生命过程。由于EGFR在众多癌细胞(如肺癌[2]、乳腺癌[3]、头颈部鳞状细胞癌[4]等)中都存在过表达，因此EGFR已成为相关癌症的重要治疗靶点。

目前，针对EGFR的肿瘤靶向药物主要分为两大类：单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。而在癌症治疗中，临床上最常用的是酪氨酸激酶抑制剂。最有代表性的是用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的gefitinib和erlotinib[5]。这些抑制剂通过与ATP竞争，可逆性地结合在EGFR胞内区激酶催化位点，从而阻止酪氨酸激酶的活化和下游信号的传导[6]，阻断因表皮生长因子对EGFR的刺激而导致的癌细胞增殖，达到诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用的目的。

虽然这类酪氨酸激酶抑制剂对NSCLC有较好的疗效，但由于抗药性的产生，这类抑制剂的功效非常有限。目前已查明， EGFR 790号位点上的苏氨酸(T)被蛋氨酸(M)取代(T790M)，是产生上述抗药性的重要机制。T790M突变导致TKI与EGFR结合时产生空间位阻或者增加与EGFR与ATP的亲和力，使得这类可逆性结合的竞争性抑制剂的抗癌效果大大减弱[7]。因此需要开发新的药物来克服这种抗药性。针对EGFR T790M突变的不可逆抑制剂，能够与保守的EGFR Cys797巯基上的硫原子发生共价相互作用，产生不可逆的抑制作用[8]，克服上述耐药性。目前已经开发了一些具有生物活性的喹啉/喹唑啉类等骨架的不可逆抑制剂[9]，有的已进入了临床研究阶段。但这些化合物在临床上表现并不令人满意[10-13]。因此，针对EGFR的不可逆抑制剂的研究，还有待进一步深入。

基于此，Zhou等[14]针对EGFR T790M开发了一类非喹啉/喹唑啉骨架的新型不可逆抑制剂，如图1所示。在对PC9 GR细胞株[14-16]的体外实验中，这类WZ系列的抑制剂表现出强劲的抗癌效果。WZ系列的抑制剂的抗癌活性，比已进入临床试验阶段的不可逆抑制剂HKI-272[14, 17-18]，还要高100多倍[14]。为什么WZ系列的抑制剂有如此高的抗癌活性呢？为了探寻在其核心骨架结构与HKI-272的骨架结构有所差异的表象之外的内在因素，从更深层面研究EGFR的不可逆抑制剂，笔者尝试用密度泛函理论(DFT)对上述不可逆抑制剂进行研究。

HKI-272

WZ3146

WZ4002

WZ8040

SerialNumberHKI⁃272WZ3146WZ4002WZ8040elementΔqelementΔqelementΔqelementΔq1C-0．097C-0．001C-0．004C-0．0622C0．017N-0．033N-0．030N-0．0313C-0．002C-0．031C-0．022C0．0014N-0．057N-0．017N-0．018N-0．0615C-0．022C-0．075C-0．066C-0．0716C-0．028C-0．019C-0．010C0．0177N-0．017O-0．008O-0．008S-0．0538C0．013C-0．004C-0．006C-0．0059C-0．008C-0．017C-0．015C-0．01010C-0．008C-0．053C-0．057C-0．05411C-0．004C-0．022C-0．019C-0．00812C0．000C-0．011C-0．014C-0．01413C-0．023C-0．020C-0．024C-0．03514C0．007N-0．003N-0．004N-0．00215O-0．008C-0．075C-0．081C-0．06916Cl-0．027C-0．044C-0．051C-0．04317N-0．085C-0．135C-0．147C-0．12818C0．005O-0．081O-0．085O-0．07619C-0．003N-0．007N-0．009N-0．01120C-0．031C0．003C0．006C0．01321C-0．001C-0．007C0．004C-0．00922N-0．024C-0．028C-0．028C-0．01823C-0．014C-0．003C-0．008C0．00224C-0．013C0．003C-0．014C0．00425C-0．067C-0．022C-0．003C-0．01426C-0．020N-0．006N-0．006N-0．00327C-0．031C-0．001C-0．001C-0．00128C-0．043N-0．002N-0．003N0．00029O-0．011C0．001C0．000C0．00230N0．004C0．004C0．003C0．00431C-0．043C0．000C0．001C-0．00132C-0．001C0．003C0．003C0．00333C-0．066Cl-0．039Cl-0．039Cl-0．04034C0．009H-0．012H-0．010H-0．01135N0．006H-0．013H-0．013H-0．01336C0．006O-0．00137C0．004C0．00438O-0．03539C0．00240C0．00541H-0．01542H-0．012

注: 除分子中的极性氢原子外，其余氢原子上的电荷变化未列出；

表中突出显示的C原子对应于图1中箭头所指β位烯键碳原子。

1 计算方法

图1所示的抑制剂的三维结构，用以下方法得到。首先，用MarvinSketch(http://www.chemaxon.com)构建其三维结构并在分子力学水平用MMFF94力场[19]优化；然后将优化后的结构经hyperchem (http://www.hyper.com)在半经验水平选用AM1[20]方法依次用Steepest Descent和Fletcher-Reeves算法进一步优化；最后用Gaussian 03[21]在B3LYP/6-31G(d)理论水平优化直到收敛。在上述优化结构的基础上，用GaussView 3.09绘制分子轨道图，并在相同理论水平分别作在电中性时和在带一个单位负电荷时的NBO分析，计算其NBO电荷分布。

将上述优化后的WZ3146、WZ4002和WZ8040，用omega2 为其产生构象，最大构象数设为2000。将T790M EGFR的晶体结构 (PDB ID:3IKA[14]) 用FRED_Receptor2.5处理。选择恰当的打分函数，重现WZ4002在T790M EGFR结合位点中的构象，然后用同样的打分策略，再将WZ3146和WZ8040对接到T790M EGFR结合位点。

2 结果与讨论

不可逆抑制剂与T790M EGFR间的相互作用，至少有两点值得关注。其一是抑制剂的化学反应位点。因为不可逆抑制剂将与EGFR中保守的Cys797残基侧链上的巯基硫原子发生Michael加成反应[17]。在图1所示的不可逆抑制剂中，该位点是分子中丙烯酰胺部分的β位烯键碳原子(图中上方箭头所指)。其二是不可逆抑制剂中，将与EGFR结合位点铰链区(hinge region)中的Met793形成氢键的原子的荷电状况。与Met793形成氢键是EGFR抑制剂的基本且重要的特征[14, 18, 22]。

2.1 抑制剂反应位点的电荷变化

对于一个含有N个电子的分子，以同一几何结构分别计算其电中性时的NBO电荷分布和带一个单位负电荷(N+1个电子)时的NBO电荷分布，从二者电荷分布的变化中可以发现，电荷分布变化越大的原子，越有可能成为参与亲电反应的位点[23]。对所研究的4个不可逆抑制剂做上述计算，所得电荷分布变化情况见表1。

表2 EGFR T790M不可逆抑制剂的抗癌活性[14]和氢键受体电荷分布数据

如表1所示，在WZ系列所有不可逆抑制剂中，电荷变化最大的都是丙烯酰胺部分的β位烯键碳原子(对应于表1中编号17的碳原子或图1中箭头所指碳原子)，变化值在0.13左右。实际情况是，EGFR中保守的Cys797残基侧链上的巯基硫原子，向抑制剂中丙烯酰胺部分的β位烯键碳原子发动亲核进攻，发生Michael加成反应。计算结果与实际情况是一致的。而在不可逆抑制剂HKI-272中，其β位烯键碳原子(对应于表1中的编号33的碳原子)上的电荷虽然也有较大的变化(变化值为0.066)，但该原子不是整个分子中电荷变化最大的原子。这可能意味着，该分子的β位烯键碳原子依然存在着被EGFR中保守的Cys797残基侧链上的巯基硫原子亲电进攻的可能，但该碳原子参与Michael加成反应的能力，远不如WZ系列抑制剂中的同类碳原子。这也恰好对应于HKI-272的抗肿瘤活性远低于WZ系列抑制剂的抗肿瘤活性的实验现象(见表2)。

2.2 氢键受体的电荷分布

与EGFR结合位点铰链区中的Met793形成氢键，是不可逆抑制剂的基本且重要的特征[14, 18, 22]。参与形成氢键、为Met793的氨基极性H提供氢键受体的，是图1中箭头所指的N原子。对抑制剂在B3LYP/6-31G(d)// B3LYP/6-31G(d)理论水平做NBO电荷分析，其氢键受体N原子上的电荷数据，见表2。

氢键的本质是静电相互作用。氢键受-供体间的电荷差异越大，距离越近，氢键的作用强度也越大。表2数据表明，HKI-272分子中氢键受体N原子的NBO电荷为-0.47，而WZ系列抑制剂中氢键受体N原子的NBO电荷均在-0.53左右。可以推断，在相同作用距离的情况下WZ系列抑制剂与T790M EGFR间的氢键作用将强于HKI-272与T790M EGFR间的氢键相互作用。这种推测与实验结果是一致的。如图2所示，实验测定WZ-4002与T790M EGFR间形成的氢键受-供体间距离[14]为2.030 nm，而与HKI-272间形成的氢键受-供体间距离[18]为2.151 nm。

(a)(b)(c)(d)

图2 T790M EGFR与(a)HKI-272 (PDB ID:2JIV[18])、 (b) WZ4002 (PDB ID:3IKA[14])、(c)WZ3146、(d)WZ8040间的相互作用图。 (注：(b)、(c)、(d)中的棒状分子为分子对接构象；线状分子则为WZ4002在T790M EGFR中的实验测定构象)

WZ系列抑制剂与T790M EGFR间的氢键相互作用更强这一点，也与WZ系列抑制剂的抗癌活性远强于HKI-272相对应。不仅如此，4个不可逆抑制剂的抗肿瘤活性的对数值还与对应分子中氢键受体N原子上的NBO电荷分布间，高度相关。这在一定程度上意味着，不可逆抑制剂与T790M EGFR间的氢键相互作用，对抑制剂的抑制功效有很大的贡献。

2.3 相关原子轨道对LUMO分子轨道的贡献

2个方面的因素促使笔者从分子轨道的角度来讨论这个问题。1)抑制剂中嘧啶环或喹啉环上的氮原子作为氢键受体(图1下方箭头所指)与T790M EGFR中的Met793骨架氮上的氢形成氢键(如图2所示)。2)这些不可逆抑制剂作为亲电试剂与T790M EGFR中保守的Cys797残基侧链巯基硫原子发生Michael加成反应，产生C-S共价结合。无论是作为亲电试剂还是作为氢键受体，都有接受电子转移到倾向。因此，从各抑制剂的LUMO分子轨道图中，可以直观地观测到相关原子对分子轨道贡献的信息。

图3 是各抑制剂的LUMO分子轨道图。从图中(上方箭头所指)可以看到，每个抑制剂分子中丙烯酰胺部分的β位烯键碳原子的2P轨道，都对整个分子的LUMO分子轨道有贡献。但是，在WZ系列抑制剂中，β位烯键碳原子的2P轨道对LUMO分子轨道的贡献大，而在HKI-272分子中，这种贡献则小得多。这种差异，与它们的抗肿瘤活性间的差异是一致的。

考察抑制剂中氢键受体原子对分子LUMO轨道的贡献，也观察到同样的现象。HKI-272分子中喹啉环上氮原子的2P轨道对LUMO分子轨道的贡献(图2下方箭头所指)很小，而在WZ系列抑制剂中，嘧啶环上氢键受体氮原子(图2下方箭头所指)的2P轨道对LUMO分子轨道的贡献则大得多。这也与WZ系列抑制剂的抗肿瘤效果远优于HKI-272相对应。

HKI-272

WZ3146

WZ4002

WZ8040

3 结语

不可逆抑制剂与T790M EGFR中保守的Cys790残基发生Michael加成反应。抑制剂中的亲电反应位点与Cys790残基侧链上的巯基硫原子形成共价键。用密度泛函理论(DFT)在B3LYP/6-31G(d)计算水平上对T790M EGFR不可逆抑制剂HKI-272及WZ系列不可逆强效抑制剂进行了研究。利用NBO电荷的变化分析了分子中反应位点参与Michael加成反应的能力。结果表明， HKI-272分子中的亲电反应位点(丙烯酰胺部分的β位烯键碳原子)参与Michael加成反应的能力，远不如WZ系列抑制剂中的同类碳原子。这与HKI-272的抗肿瘤活性远低于WZ系列抑制剂的抗肿瘤活性的实验现象相对应。

抑制剂分子提供氢键受体，与EGFR Met793的氨基极性H形成氢键。对抑制剂分子的NBO电荷分析表明，WZ系列抑制剂中参与形成氢键的氢键受体N原子所带负电荷，均多于HKI-272分子中的相应N原子所带负电荷。而且，氢键受体N原子所带负电荷与抑制剂的抗肿瘤活性高度正相关。

抑制剂分子的LUMO分子轨道图显示，HKI-272分子中参与Michael加成反应的丙烯酰胺部分的β位烯键碳原子2P轨道对LUMO分子轨道的贡献，小于WZ系列分子中的相应β位烯键碳原子2P轨道对相应分子的LUMO轨道的贡献。HKI-272分子中参与形成氢键的氢键受体N原子的2P轨道对LUMO轨道的贡献，也小于WZ系列分子中的相应受体N原子的2P轨道对相应LUMO轨道的贡献。

综上所述，不可逆抑制剂参与Michael加成反应的能力、与EGFR形成氢键的强弱等，都是影响抑制剂发挥抗肿瘤功效的重要因素。较之于HKI-272，WZ系列不可逆抑制剂能与EGFR形成更强烈的氢键相互作用，有更强的参与Michael加成反应的能力，因而发挥出更强的抗肿瘤功效。

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ToRevealtheEssentialFactorsWhichAreDeterminantforthePotentAnti-tumorActivityofWZ-seriesIrreversibleInhibitorsagainstT790MEGFRbyEmployingDFTInvestigation

LEIKai,LIUXiangjun,CHENLijuan,YANGMingli,XIANGMingli

(State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041,China)

WZ-series irreversible inhibitors are much more potent against T790M EGFR than HKI-272, one of the inhibitors currently under clinical development. All of them were investigated at the B3LYP/6-31G(d) level by employing G03 so as to reveal the essential factors vital for the potent antitumor activities of the WZ-series inhibitors. It was demonstrated that the WZ-series inhibitors are superior to HKI-272 in the capability to participate in Michael addition reaction. It could be speculated from the calculated results that the strength of H-bond formed between WZ-series inhibitors and T790M EGFR would be stronger than that between HKI-272 and the mutant EGFR. It is worth to note that the values of NBO charge of the H-bond donor in the inhibitors are highly relevant to the antitumor activities of the inhibitors.

EGFR; Irreversible Inhibitor; T790M Mutation; Density Functional Theory

2013-04-24

国家自然科学基金资助项目“原子和分子团簇的局域-离域极化理论模型及其应用”(批准号：20873088)

雷凯(1988- )，男(汉族)，山东泰安人，在读硕士研究生，研究方向：分子模拟与计算机辅助药物设计。

O621.1

A

2095-5383(2013)02-0001-05