HPLC法测定清瘟败毒颗粒中盐酸小檗碱的含量研究

郭时金,王艳萍，周春凤，董 林，徐倩倩，张志美，沈志强

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都安特动物药业有限公司，山东 滨州 256600)

鸭传染性浆膜炎、猪高热综合征、猪链球菌病、猪附红细胞体病、牛流行性感冒、犬瘟热、草鱼出血病等均是危害动物养殖业的重大疾病，严重制约着中国养殖业的发展，因而积极开展这些温热病的防治研究工作具有巨大的生产实践意义。

清瘟败毒颗粒是由石膏、黄连、知母等十四味药材组成的复方颗粒制剂，具有泻火解毒、凉血之功效，中兽医上常用于缓解或治疗畜禽热毒发斑、高热神昏症状[1]。方中重用石膏清热泻火，为君药；知母配合石膏清气分实热，水牛角、地黄、牡丹皮、玄参和赤芍凉血解毒清血分热，为君药；黄连、栀子、黄芩和连翘通泻三焦火热，为佐药；桔梗宣肺、载药上行，淡竹叶清心利尿、导热下行，甘草调和诸药，为使药。诸药合用，共奏泻火解毒、凉血之功。

清瘟败毒散在兽医临床上主要用于治疗鸭传染性浆膜炎、猪高热综合症、猪链球菌病、犬瘟热等瘟性烈性疾病。清温败毒颗粒是清温败毒散的改剂型制剂，目前还未建立质量标准。黄连是清瘟败毒颗粒中的重要药味，其主要药效成分为盐酸小檗碱，盐酸小檗碱的测定方法报道较多，复方颗粒制剂中盐酸小檗碱的分离、测定方法也有报道，但应用已报道的方法难以将清瘟败毒颗粒中的盐酸小檗碱分离开来[2]。本试验拟建立清瘟败毒颗粒剂中盐酸小檗碱含量的测定方法，为质量标准的建立提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 仪 器 Agilent 1260高效液相色谱系统(含Agilent色谱工作站软件，安捷伦科技公司)；ALC-210.4型电子天平(北京赛多利斯股份有限公司)。

1.1.2 药 品 乙腈(色谱醇)，山东禹王实业有限公司化工分公司；磷酸二氢钾，天津市天力化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠，天津市天力化学试剂有限公司。

“瘟败毒颗粒”，山东绿都安特动物药业有限公司生产，批号20120312、20120321、20120405、20120409、20120412和20120415。盐酸小檗碱对照品，批号Z0220712，中国药品生物制品研究所。

1.2 方 法

1.2.1 色谱条件与系统适用性试验 SB-C18液相色谱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH为4.0)；检测波长为345 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算不低于5000。

1.2.2 溶液的制备

1.2.2.1 对照品溶液 取盐酸小檗碱对照品适量，于60 ℃真空干燥至恒重，精密称定2.000 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成每1 mL含80.0 μg的溶液。准确量取上述溶液至1、2、2.5、3 mL至5 mL容量瓶中，分别用甲醇稀释至刻度线，配成浓度为16、32、40、48 μg/mL的系列储备液。

1.2.2.2 供试品溶液 取清瘟败毒颗粒粉末6份，每份3.125 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40 kHz)助溶30 min，放冷，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，量取续滤液约1 mL，置样品瓶中，备用。

1.2.2.3 阴性对照品溶液的制备 取不含各味药材提取物的颗粒作为阴性对照样品，依照供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

1.2.3 标准曲线的制备 精密吸取各浓度盐酸小檗碱对照品溶液10 μL进样，按照2.1方法检测，记录峰面积(Y，以盐酸小檗碱峰计)为纵坐标，以盐酸小檗碱浓度(X，μg/mL)为横坐标，用峰面积Y对浓度X进行回归处理并做标准曲线。

1.2.4 重复性试验 精密量取同一批号，浓度为80.00 μg/mL盐酸小檗碱对照品溶液10 μL，在同样条件反复进样6次，记录盐酸小檗碱的峰面积。

1.2.5 稳定性试验 在同一色谱条件下，精密吸取对照品储备液10 μL，于0、1、3、6、12、24 h各进样一次进行峰面积测定并比较。

1.2.6 空白试验 按处方比例和要求，制成不含清瘟败毒方剂各味药物的空白颗粒，精密称取1 g空白对照颗粒，加入10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，按照2.1方法检测，重复3次。

1.2.7 回收率试验 利用加样回收法，测定盐酸小檗碱含量。精密量取5 mL制备好的供试品溶液放入5 mL容量瓶中，用于颗粒中，另取6份20 mL供试品溶液分别加入准确称量的盐酸小檗碱对照品1.6 mg，立即称量，超声处理后，放至冷却，继续称量，将减失的重量用甲醇补齐。将此6份溶液在已设定的色谱条件下依次进样10 μL，用以测定含量。

1.2.8 样品含量的测定 将加样回收试验中的精密量取的6份供试品溶液5 mL，每份重复3个水平测定颗粒中盐酸小檗碱含量，取其平均值作为颗粒中盐酸小檗碱的含量。

2 结果与分析

2.1 方法的专属性

分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL，在2.1色谱条件下，供试品中盐酸小檗碱与对照品色谱峰保留时间一致，并与其他共存成分的分离度良好>1.5，且阴性样品在相应的位置上无色谱峰干扰(见图1、2、3)。

2.2 线性关系考察

根据盐酸小檗碱在所选色谱条件下峰面积和浓度的关系，得回归方程：Y=240.79X-14.034(R2=1)。线性结果表明，盐酸小檗碱在测量范围内与峰面积具有呈良好的线性关系。

2.3 重复性试验

重复性试验结果见表1。由表1可知，相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)为1.16%，表明该方法重复性好。

2.4 稳定性试验

在同色谱条件下，精密吸取同盐酸小檗碱对照品溶液10 μL，在0、1、3、6、12、24 h各一次样进行检测，色谱峰面积的RSD为0.46%，表明盐酸小檗碱在24 h内稳定，同时也说明该试验稳定性较好。

2.5 空白试验

在盐酸小檗碱保留时间点及其附近无杂峰出现，说明该方法下制剂辅料对盐酸小檗碱的含量测定不会产生干扰。

图1 盐酸小檗碱色谱图Fig. 1 The chromatogram of Berberine hydrochloride

图2 清瘟败毒颗粒色谱图 Fig. 2 The chromatogram of Qingwen Baidu granule

图3 空白制剂对照色谱图Fig. 3 The chromatogram of Negative control

2.6 回收率试验

将测定结果代入回归方程进行分析，平均回收率为99.09%，RSD 为0.343%(见表2)。表明该种方法回收率高，准确度良好。

2.7 样品含量测定

样品含量测定结果见表3。由表3可知，不同批次，相同工艺制作的清瘟败毒颗粒中盐酸小檗碱的含量接近，大约为25 μg/g颗粒。

表1 重复性试验结果Table 1 Results of repeatability test

表2 加样回收试验测定结果(n=6)Table 2 The results of recovery test for samples added

表3 样品测定结果(n=6)Table 3 The results of sample test

3 讨 论

3.1 方法的选择

中药复方制剂中盐酸小檗碱含量测定法一般有薄层色谱及HPLC测定法，但因薄层色谱定量法手动操作环节较多，人为影响因素大，重现性不好，反之高效液相色谱法(HPLC)灵敏度高、专属性强且方法快捷、准确[3]，所以本试验选择了HPLC法测定清瘟败毒颗粒中盐酸小檗碱的含量。结果表明本法分离效果良好、简便快捷、专属性强、准确度高且重现性好，可作为该制剂质量控制的方法之一。

3.2 流动相的选择

根据文献报道，高效液相色谱法检测制剂中盐酸小檗碱含量的方法主要有以下2种系统，即乙腈-磷酸(或磷酸缓冲盐)系统[3-4]和甲醇-醋酸-三乙胺-水系统[5-6]，后者为四元系统，组成较为复杂。参考以上方法，通过多次调整溶剂系统的乙腈和磷酸盐的比例对制剂中的盐酸小檗碱的含量进行测定，最后确定以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(50∶50)的混合溶液为流动相，这与2010版药典中盐酸小檗碱的检测方法相一致[1]。色谱图表明，盐酸小檗碱峰与制剂中其他杂峰分离良好，且峰型对称性良好。

3.3 吸收波长的确定

据参考文献报道[7-15]，盐酸小檗碱含量采用的检测波长较多，如254 nm、265 nm、350 nm、345 nm、346 nm和349 nm等。本研究对盐酸小檗碱对照品溶液在分光光度计下进行了紫外图谱扫描，结果显示在345 nm为最大吸收波长，这也与2010年版《中华人民共和国兽药典》检测波长一致[1]，故选定345 nm为检测波长。

4 结 论

本试验所建立的清瘟败毒颗粒中盐酸小檗碱的HPLC检测方法，加样回收率高，平均回收率为99.09%，RSD为0.34%<2%，在16.0～48.0 μg/mL范围内盐酸小檗碱的峰面积与含量之间呈直线关系，方法简单、快速、灵敏、精确，可应用于清瘟败毒颗粒剂中盐酸小檗碱的含量测定及清瘟败毒颗粒剂质量标准的制定。

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