在线凝胶渗透色谱/气相色谱－质谱联用法测定水果中11种苯氧羧酸类农药

张 帆，付善良，施雅梅，李忠海，张 莹，王美玲，颜鸿飞，黄志强*

(1.长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙 410004;2.食品安全科学技术湖南省重点实验室，湖南省检验检疫科学技术研究院，湖南 长沙 410004;3.中南林业科技大学 食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004;4.厦门出入境检验检疫局技术中心，福建 厦门 361026)

随着农业生产的现代化，世界上第二大选择性激素类除草剂苯氧羧酸类农药凭借其高效、内吸、高度选择性的特点广泛应用于农业生产中。这类农药常被用于农作物中阔叶杂草的防治以及用作生长调节剂和水果保鲜剂［1－2］。研究表明，经苯氧羧酸类农药处理过的植物容易蓄积浓度很高的硝酸盐或氰化物等干扰内分泌的代谢产物，对人类和生物造成一定的危害［3－4］。

目前，国内外有关苯氧羧酸类农药多残留检测的文献报道多集中在土壤和水体等环境样品［5－7］，而其在食品中残留量的检测报道很少，且主要集中于粮谷类农作物［8－10］。已有的苯氧羧酸类农药的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱－质谱联用法、液相色谱法及液质联用法，前两者需以三氟化硼衍生，操作繁琐且毒性较大;后两者虽不需要衍生，但液相的检测灵敏度较低，液质联用仪则价格较为昂贵。凝胶渗透色谱净化技术能有效地去除样品基质中的色素等干扰杂质，但常规的凝胶渗透色谱多采用离线方式，样品处理时间长、溶剂消耗大、操作繁琐。本文采用在线凝胶色谱/气相色谱－质谱联用技术，结合大体积进样，同时对水果中的11种苯氧羧酸类农药残留进行分析，实现了从样品前处理到农药分析的自动化，为打破农产品国际贸易技术壁垒，促进水果外贸出口以及有效地保障水果的食用安全提供了科学数据［11－15］。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

在线凝胶渗透色谱/气相色谱－质谱联用仪(GPC/GC－MS)，配有程序升温(PTV)进样口和电子轰击离子(EI)源(日本岛津公司)。农药标准品(Dr.Ehrenstorfer Co.，Germany);正己烷、丙酮、环己烷、正丁醇(色谱纯，美国Tedia公司);无水硫酸钠、浓硫酸(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司);农药标准品:用丙酮配成标准储备液(100 mg/L)，根据检测要求用流动相稀释成相应的标准工作溶液。实验用水为超纯水。

1.2 样品前处理

1.2.1 提取取5 g(精确至0.01 g)样品于50 mL离心管中，加入2 mL 6 mol/L的盐酸及2 mL丙酮于旋涡混合器上振荡3 min，然后加入4 mL正己烷超声提取15 min，离心3 min(6 500 r/min)后，将上层有机相清液转移至另一支玻璃刻度试管中，下层残渣用正己烷(每次4 mL)重复提取2次，合并提取液，于40℃下氮气吹干。

1.2.2 衍生向上述玻璃刻度试管中加160 μL正丁醇、40 μL浓硫酸，加塞混匀后于80℃下放置50 min进行丁酯化衍生反应。每次用2 mL正己烷重复提取3次，合并提取液，在氮气吹干仪上浓缩至约1 mL，待过柱净化。

1.2.3 净化在Florisil固相萃取柱中加入约1 cm高的无水硫酸钠，用丙酮－正己烷混合溶液(1∶9)活化柱后，将样品的酯化液上样，用丙酮－正己烷混合溶液(1∶9)淋洗，以1 mL/min的速度收集5 mL，取1 mL洗脱液用氮气吹至近干，用流动相丙酮－环己烷溶液(3∶7)定容至1 mL，供在线GPC/GC－MS测定。

1.3 分析条件

GPC条件:Shodex EV200凝胶渗透色谱柱(2 mm×150 mm);流动相为丙酮－环己烷溶液(3∶7)，流速0.1 mL/min;进样量10 μL。

色谱条件:色谱柱为惰性熔融石英毛细管柱(5 m×0.53 mm);DB-5MS预柱(5 m×0.25 mm×0.25 μm);DB-5MS分析柱(25 m×0.25 mm×0.25 μm);柱温:82℃(保留5 min)，以15℃/min升至200℃，再以30℃/min升至300℃(恒温5 min);进样口:PTV进样口;进样口温度:120℃(保留5 min)，再以100℃/min升至250℃(恒温15 min);不分流进样;载气为高纯氦气，流量为1.75 mL/min。

质谱条件:离子化方式:电子轰击电离源(EI)，电离能量:70 eV;传输线温度:250℃;离子源温度:200℃;溶剂延迟9.7 min;扫描方式:选择离子监测模式(SIM)。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

根据水果基质含色素多的特点和检测的目标化合物为强极性酸性化合物的物理化学性质，本实验分别选用丙酮－正己烷、丙酮－乙酸乙酯和丙酮－乙醚3种混合溶剂提取，丙酮只在第1次提取时加入2 mL。发现3种混合溶剂的提取效率相当，但丙酮－乙酸乙酯和丙酮－乙醚提取出的杂质相对较多。考虑到乙醚的易挥发性和对人体的麻醉性，不宜作提取溶剂。而乙酸乙酯的沸点相对较高，氮气吹干所需的时间很长，且浪费氮气。故本实验选用丙酮－正己烷作提取溶剂。

2.2 酸度对农药提取效率的影响

由于苯氧羧酸类农药是有机酸，在酸性条件下保持稳定并易被提取，实验中用盐酸将样品溶液调成不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)后进行提取。数据显示，11种苯氧羧酸类农药的回收率受酸度影响较显著，pH 2.0～3.0时，大部分农药的回收率集中在80%～100%之间。因此，为了保证农药的回收率，应尽量保证样品溶液的pH值在2.0～3.0之间。

图1 11种苯氧羧酸类农药混合标准品(0.1 mg/L)的总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatogram of 11 phenoxy acid pesticides standards mixture(0.1 mg/L)

2.3 衍生条件的选择

苯氧羧酸类农药具有羧羟基，极性较强，需要通过衍生反应转化为弱极性、易挥发的化合物来进行分析。参考标准和文献方法［10，16］，分别采用三氟化硼甲醇溶液(5 mL)、三氟化硼丁醇溶液(5 mL)在70℃水浴中进行衍生反应，正丁醇－硫酸(4∶1)作为衍生化试剂在室温下进行衍生反应。结果表明，这3种方法的衍生效率无明显差别。由于三氟化硼毒性很大，需在水浴加热环境中进行反应，且衍生操作繁琐。而正丁醇－硫酸的衍生效率较高，丁酯化过程中产生的干扰物质较少，操作较为简便，因而最终选择正丁醇－硫酸(4∶1)作为衍生试剂。

为了进一步提高衍生效率，考察了不同衍生时间(10、20、30、40、50、60 min)及衍生温度(室温、30、40、50、60、70、80℃)对衍生反应的影响。结果显示，11种苯氧羧酸类农药的衍生化反应在40 min时达到峰值，随着时间的延长，峰值无明显变化，为了确保衍生反应完全，选择衍生化反应时间为50 min。另外，目标化合物的回收率随着衍生温度的升高而升高，70℃后其回收率无明显变化，为了保证农药的回收率，本实验选取80℃作为最佳衍生反应温度。图1为优化条件下11种苯氧羧酸类农药衍生物(0.1 mg/L)的标准色谱图。

2.4 固相萃取条件的选择

比较了C18柱、Florisil柱、Si柱和NH2柱4种固相萃取柱的净化效果，发现C18柱的净化效果不理想，谱图中的杂质峰干扰较大;Si柱和NH2柱的回收率较低，并且不能将11种苯氧羧酸类农药完全洗脱;而经Florisil柱净化后，可有效地去除色素等杂质，在色谱图中干扰最小，回收率结果也符合标准要求，因此选定Florisil柱为净化载体。

2.5 在线GPC净化

由于水果中含有大量色素和少量油脂，从而增加了净化的难度。样品在进入质谱分析前通过在线GPC的进一步净化，可以大大减少进入GC－MS系统的大分子干扰物质，使基质干扰的问题得到解决，同时取代了经典的GPC净化方式，缩短了分析过程，从而实现了从样品净化到分析检测的自动化，减少了人工操作带来的分析偏差，并提高了实验室的工作效率。另外采用2 mm内径的GPC微型柱，消耗的有机溶剂大大减少，降低了溶剂对人和环境产生的影响。图2为经净化后的苹果样品空白及添加了11种苯氧羧酸类农药的加标苹果样品的色谱图。

2.6 线性关系与检出限

用GPC流动相丙酮－环己烷溶液(3∶7)配制系列标准工作溶液，在“1.3”分析条件下进行测定。以农药选择离子的峰面积(Y)对其质量浓度(X，mg/L)作图，求得线性方程和相关系数(见表1)。11种化合物在0.01～1.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数均不低于0.998 7。以10倍信噪比计算得11种苯氧羧酸类农药的定量下限为7～10 μg/kg。

图2 苹果空白(A)及添加0.1 mg/kg混合标准品苹果样品(B)的色谱图Fig.2 Chromatograms of blank apple sample(A)and apple sample spiked with 0.1 mg/kg phenoxy acid pesticide standards mixture(B)the numbers denoted were the same as those in Fig.1

表1 11种苯氧羧酸类农药的保留时间、定量定性离子、线性关系及定量下限Table 1 Retention times，quantitative ions，qualitative ions，linear relationships and quantitation limits of 11 phenoxy acid pesticides

2.7 回收率与精密度

在优化条件下对11种苯氧羧酸类农药在苹果、香蕉和柑橘3种水果中进行3个水平的加标回收实验，每个加标水平平行6次，回收率和相对标准偏差如表2所示。由表可见，3个加标水平下的回收率为66%～112%，相对标准偏差(RSD)为3.4%～11.5%，方法的准确度及精密度可满足水果中11种苯氧羧酸类农药残留的检测要求。

表2 苹果、香蕉和柑橘中11种苯氧羧酸类农药的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of 11 phenoxy acid pesticides in apple，banana and orange samples at three spiked levels(n=6)

(续表2)

2.8 实际样品的检测

为了验证本方法的可行性，从市场购买了香蕉和柑橘样品，按照所建立的方法进行处理并测定其中苯氧羧酸类农药的残留量。结果在柑橘样品中11种苯氧羧酸类农药均有检出;香蕉样品中检出2，4-D，含量为0.058 mg/kg，其他农药成分均未检出。

［1］Anastassiades M，Chwack S.J.Chromatogr.A，1998，825(1):45 －54.

［2］Zhang Y J，Zhang D S，Liu Z Y，Li J M，Song J K.Pesticides(张玉聚，张德胜，刘周扬，李菊梅，宋敬魁.农药)，2003，42(1):41－43.

［3］Niu Z Y，Luo X，Tang Z X，Ye X W，Sun Y F，Zhang H W，Wang F M.Chin.J.Anal.Chem.(牛增元，罗忻，汤志旭，叶曦雯，孙银峰，张鸿伟，王凤美.分析化学)，2009，37(4):505－510.

［4］Kuang H，Hou Y X，Chu X G，Xu C L.Chin.J.Anal.Chem.(匡华，侯玉霞，储晓刚，胥传来.分析化学)，2006，34(12):1733－1736.

［5］D browska D，Kot－ Wasik A，Namies＇nik J.Bull.Environ.Contam.Toxicol.，2006，77(2):245 －251.

［6］Solymosné Majzik E，Tóth F，Benke L，Kiss Z.Chromatogr.Suppl.，2006，63:105 －109.

［7］Su Y L，Mo H H，An F C.Chin.J.Environ.Chem.(苏允兰，莫汉宏，安凤春.环境化学)，2001，20(6):577－581.

［8］Peng X J，Pang J S，Deng A H.Food Sci.(彭晓俊，庞晋山，邓爱华.食品科学)，2011，29(12):1199－1204.

［9］Mou R X，Chen M X.J.Instrum.Anal.(牟仁祥，陈铭学.分析测试学报)，2008，27(9):973－976.

［10］Li B，Guo D H，Han L，Yang J X，Zhang K.Chem.World(李波，郭德华，韩丽，杨景贤，张锴.化学世界)，2005，9:524－528.

［11］Hong H Y，Yin P J，Wei Y，Hao S H.Chin.J.Pesticide Sci.(洪海燕，殷培军，魏艳，郝双红.农药学学报)，2010，12(3):344－348.

［12］Wei F，Dong Z L，Yu L.J.Instrum.Anal.(卫锋，董振霖，于玲.分析测试学报)，2005，24(Suppl 1):304－306.

［13］Cheng J，Ding L，Jiang J S，Lu Y J.Food Sci.(程静，丁磊，蒋俊树，卢业举.食品科学)，2010，31(20):389－393.

［14］Fu S L，Zhang Y，Xiao J Y，Li Y J，Ding L，Yan H F.Anal.Test.Technol.Instrum.(付善良，张莹，肖家勇，李拥军，丁利，颜鸿飞.分析测试技术与仪器)，2010，16(4):262－267.

［15］Wang M，Ye F.Pesticide Science and Administration(王敏，叶非.农药科学与管理)，2008，29(6):9－14.

［16］Zhong D C.The Practical Residues Detection Method for Pesticides and Veterinary Drugs in Import and Export Food.Beijing:Standards Press of China(仲德昌.进出口食品中农兽药残留实用检测方法.北京:中国标准出版社)，2004.