miR-150缺失增强小鼠NKT细胞IFN-γ产生并促进小鼠Ⅰ型糖尿病的发生①

郑全辉 张爱红 郑爱华 陈淑媛 侯志宏 高金明 郑建兴 李 娟

(河北联合大学基础医学院，唐山063000)

NKT细胞是CD1d依赖的自然杀伤性T细胞(CD1d dependent natural killer T cells)，因其细胞表面既表达 TCRα 链(小鼠:Vα14-Jα18，人:Vα24-Jα18)和 Vβ 链 (小鼠:Vβ8.2，Vβ7，Vβ2，人:Vβ11)，同时又表达 NK 细胞受体如 NK1.1、IL-2/15受体β(CD122)等而命名［1］。在外周免疫器官，NKT细胞特异识别由CD1d分子提呈的糖脂类抗原α-半乳糖苷神经酰胺(α-Galcer)而活化，活化NKT细胞能在短时间内产生大量Th1和Th2型细胞因子如IL-4和IFN-γ，从而在抗感染、自身免疫性疾病及肿瘤治疗中发挥重要的作用［2］。

microRNAs(miRNAs)属于短链非编码RNAs，长度为20～23nt，通过与靶mRNA 3'端非翻译区结合，导致靶mRNA降解或抑制其翻译，负向调节靶基因的表达［3］。miR-150是淋巴细胞特异表达的microRNA，Zhou等［4］最早发现 miR-150缺失导致 B细胞异常扩增，体液免疫应答显著增强，但对CD4和CD8传统T细胞的发育和功能没有影响，表明miR-150在不同淋巴细胞发育和功能中发挥不同的作用。然而，miR-150在NKT细胞发育和功能中的作用目前还不清楚。在此研究中，我们采用miR-150基因敲除(miR-150KO)小鼠，发现miR-150基因缺失不影响外周NKT细胞的数量，但导致NKT细胞IFN-γ产生增加。在STZ处理糖尿病小鼠模型中，发现α-Galcer处理miR-150敲除小鼠与对照WT小鼠相比，糖尿病的发生显著提前。以上研究结果为探索microRNA对NKT细胞功能的影响及其在自身免疫性疾病中的作用提供了新的线索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 小鼠 C57BL/6背景的miR-150基因敲除小鼠(miR-150KO)和野生型对照 C57BL/6小鼠(WT)由Qing-Sheng Mi博士(美国密歇根亨利·福特医院)惠赠，并在河北联合大学SPF级小鼠房繁殖、饲养。实验选取4～6周龄、性别匹配小鼠进行研究。小鼠实验操作按河北联合大学实验动物管理委员会规定进行。miR-150敲除小鼠基因型鉴定采用下列引物:上游:5-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3;下游 5-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3;miR-150KO小鼠产生262 bp片段，WT小鼠产生866 bp片段。

1.1.2 试剂 MirVana miRNA提取试剂盒和Taq-Man MicroRNA检测试剂盒购自美国Ambion公司。α-半乳糖神经鞘氨醇(α-Galcer)及荧光素标记的CD1d-α-Galcer四聚体购自日本麒麟公司，荧光素标记的抗小鼠 TCR-β(H57-597)、抗 B220(RA3-6B2)、抗 IL-4(11B11)、抗 IFN-γ (XMG1.2)抗体和细胞内染色试剂盒购自BD公司，大鼠抗小鼠FcR单克隆抗体(2.4G2)取自 2.4G2杂交瘤细胞培养上清，IFN-γ和IL-4 ELISA检测试剂盒购自北京达科为生物技术公司，链脲佐菌素(STZ)购自Sigma，引物由上海生物工程服务公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 流式细胞仪分析 分别分离小鼠胸腺、脾、肝脏、骨髓和淋巴结并制成单细胞悬液，用含2%小牛血清的PBS染色缓冲液洗涤两次，加入2.4G2封闭，4℃ 30分钟，然后直接加入适当浓度荧光素标记的单克隆抗体，4℃ 30分钟。染色缓冲液洗涤两次，采用BD-LSRⅡ流式细胞仪收集标本，CellQuest Pro(BD Biosciences)软件进行数据分析。

1.2.2 NKT细胞活化及细胞内染色分析 将α-Galcer首先溶于二甲基亚砜(DMSO)，终浓度为100 μg/ml。取 2 μg α-Galcer 于 100 μl磷酸盐缓冲液(PBS)中，经尾静脉注入小鼠体内，溶剂对照采用相同剂量DMSO。4小时后分离小鼠脾细胞，1×红细胞裂解液处理去除红细胞，取2×106细胞/样品重悬于RPMI1640培养液(含10%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，10 mmol/L HEPES，50 mmol/L 2-巯基乙醇)，同时加入 GolgiStop，37℃培养2小时。细胞(1×106/100 μl)首先经细胞表面染色，冷PBS洗涤后加入新鲜配置固定/透膜液(1∶3稀释)0.5 ml，4℃避光孵育30～60分钟。加入2 ml 1×固定/透膜液洗涤一次，加入2.4G2 4℃封闭15分钟，直接加入抗小鼠IFN-γ和IL-4抗体进行细胞内染色，4℃避光孵育30分钟，2 ml 1×固定/透膜液洗涤两次，流式细胞仪分析。

1.2.3 酶联免疫吸附实验(ELISA) 采用结合缓冲液(0.1 mol/L Na2HPO4，pH9.0)稀释抗小鼠 IL-4和 IFN-γ 抗体至 2 μg/ml，100 μl/孔 加 入相 应ELISA板，4℃包被过夜。移除包被液，加入封闭缓冲液(1%BSA)，200 μl/每孔，室温 2小时。PBS/Tween20洗涤3次后加入1∶50稀释的α-Galcer处理小鼠血清和倍比稀释标准血清，100 μl/每孔，室温4小时。PBS/Tween20洗涤3次后加入底物显色，450 nm处测量吸光度(OD)。

1.2.4 小鼠糖尿病模型制作及α-Galcer处理 链脲佐菌素(STZ)溶于0.1 mol/L pH4.4的枸橼酸盐缓冲液，选择雄性野生型C57BL/6和miR-150KO小鼠，STZ 65 mg/kg腹腔注射，连续注射5日，STZ注射当天分别注射α-Galcer，100 μg/kg，每3天注射1次，连续注射3次。STZ注射2周后，取鼠尾血检测血糖，每周测量1次，连续测量6周。小鼠糖尿病判断标准为血糖浓度大于12 mmol/L。

1.2.5 实时定量 RT-PCR 采用 Ambion mirVana miRNA提取试剂盒分别提取WT和miR-150KO小鼠胸腺及脾脏细胞总RNA，采用TaqMan MicroRNA检测试剂盒进行反转录和PCR扩增，以snoRNU202作为内参照。PCR扩增产物检测采用ABI 7900 Real-time PCR system进行。结果分析采用^CT值，并计算相对表达。

1.3 统计学分析 数据分析采用GraphPad Prism 5或Microsoft Excel统计软件，结果采用±s表示，组间差异采用双尾Student's t检验，P＜0.05为组间有统计学差异。

2 结果

2.1 MiR-150敲除不影响小鼠外周NKT细胞的数量 基因鉴定结果表明，miR-150KO小鼠基因型正确(图1A);Real-time PCR结果显示 miR-150在miR-150KO小鼠中的表达显著降低(图1B)。采用抗-B220 抗体、抗-TCR-β 抗体和 CD1d-α-Galcer三染色，流式分析NKT细胞在miR-150KO小鼠外周免疫器官的数量变化，发现miR-150KO小鼠除在淋巴结NKT细胞的百分率和细胞数量显示增加的趋势，在NKT细胞分布的主要免疫器官如脾脏、骨髓和肝脏，miR-150KO小鼠与WT小鼠相比，NKT细胞的百分率和细胞数量没有显著变化(图1C、D)。

图1 miR-150敲除小鼠外周免疫器官NKT细胞数量变化Fig.1 NKT cell number changes in the peripheral lymph organs in miR-150KO mice

图2 miR-150KO小鼠NKT细胞IFN-γ产生增加Fig.2 Increased IFN-γ production in the α-Galcer activated NKT cells in miR-150 KO mice

图3 miR-150敲除促进α-Galcer处理小鼠糖尿病的发生Fig.3 miR-150 deletion significantly accelerates the occurrence of diabetes in α-Galcer treated mice

2.2 miR-150KO小鼠NKT细胞IFN-γ产生增加分别给miR-150KO和WT小鼠注射NKT细胞特异激活剂α-Galcer，采用细胞内染色和ELISA检测脾脏NKT细胞和血清中IFN-γ和IL-4的产生和分泌。细胞内染色结果表明，α-Galcer体内刺激4小时后，与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠IFN-γ和IL-4产生NKT细胞均有增加，其中IFN-γ产生NKT细胞的增加尤为显著(P＜0.01，图2A、B)。与细胞内染色结果一致，ELISA结果显示，miR-150KO小鼠血清中IFN-γ的量显著增加(图2C)。

2.3 miR-150敲除促进α-Galcer处理小鼠糖尿病的发生 为观察miR-150敲除NKT细胞对胰岛素依赖性糖尿病发生和发展的影响，miR-150KO和WT小鼠分别注射STZ，制备Ⅰ型糖尿病小鼠模型，同时给予α-Galcer处理活化NKT细胞，试剂对照采用等量DMSO注射。结果发现，α-Galcer处理miR-150KO小鼠在STZ注射3周后出现糖尿病，发病率为12.5%，第5周时糖尿病的发病率达50%，至第7周时，所有miR-150KO小鼠均发生糖尿病。而α-Galcer处理WT小鼠在STZ注射4周时仍无糖尿病发生，到第5周时糖尿病发生率仅为12.5%，至第7周时，α-Galcer处理 WT小鼠糖尿病发生率为62.5%(图3A、B)。与α-Galcer处理组相比，DMSO处理组miR-150KO和WT小鼠糖尿病的发病时间及发病率没有显著性差异(图3C、D)。

3 讨论

NKT细胞是近年来新发现的一个保守的T细胞亚群，起源于胸腺CD4+CD8+双阳性T细胞。大部分NKT前体细胞在经历 CD44－NK1.1－，CD44+NK1.1－和 CD44+NK1.1+三个发育阶段后成为成熟NKT细胞，然后进入肝脏、脾脏、骨髓和淋巴结等外周免疫器官，其中，脾脏和肝脏NKT细胞的分布最为丰富。另外，在CD44+NK1.1－发育阶段，一部分非成熟NKT细胞离开胸腺直接进入外周免疫器官并进一步发育成熟［5］。我们以往的研究结果发现，miR-150缺失引起小鼠胸腺NKT细胞数量减少，细胞发育受阻于 CD44+NK1.1－阶段［6］。在此研究中，我们发现miR-150KO与对照WT小鼠相比，外周NKT细胞的数量并没有显著变化，提示miR-150KO小鼠可能有更多的CD44+NK1.1－发育阶段NKT细胞自胸腺进入外周发育。与Savage等研究结果一致［7］，非成熟 CD44+NK1.1－NKT 细胞趋于进入淋巴结，与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠淋巴结NKT细胞数量增加明显(图1C、D)。

NKT细胞的一个显著特征是在受到TCR信号刺激时，能在短时间内产生大量Th1和Th2型细胞因子，进而发挥强大的免疫调节功能。在此实验中，我们发现miR-150实际上有负向调控NKT细胞的功能，细胞内染色结果表明，TCR活化miR-150敲除小鼠NKT细胞IFN-γ产生显著增加，同时IL-4的产生也显示增加的趋势;ELISA结果显示，α-Galcer处理miR-150KO小鼠与相应处理WT小鼠相比，血清IFN-γ的量也显著增加，进一步证实miR-150主要负向调控NKT细胞IFN-γ的产生和分泌。不容否认的是，活化NKT细胞可能进一步通过调节其它细胞的细胞因子产生和分泌，从而间接改变血清中IL-4和IFN-γ的含量，如IFN-γ可进一步活化NK和Th1 细胞，从而产生更多的 IFN-γ［8］。

TCR活化NKT细胞既能通过其产生和分泌的Th1细胞因子如IFN-γ和TNF-α增强细胞介导的免疫应答，也能通过Th2细胞因子发挥免疫抑制细胞的作用。尽管多数研究表明，NKT细胞特异激活剂α-Galcer抑制多种自身免疫性疾病的发生和发展，但也有相反的报道［9，10］。链脲佐菌素(STZ)是诱导糖尿病动物模型的常用药物之一，多次、小剂量STZ注射通过逐步对胰岛β细胞产生损伤而最终导致Ⅰ型糖尿病，与临床Ⅰ型糖尿病的发病过程相似。在此研究中，我们发现与WT小鼠相比，miR-150敲除不但显著增强了小鼠NKT细胞IFN-γ的产生，而且加速了α-Galcer处理小鼠糖尿病的发生。研究表明，IFN-γ作为一种重要的免疫调节因子，单独或与其它细胞因子相互作用，在Ⅰ型糖尿病的发生、发展过程中发挥重要作用。文芳等［11］体外分离培养SD大鼠胰岛细胞，分别或共同加入IL-1β和IFN-γ处理，发现IFN-γ能显著抑制胰岛素分泌，促进胰岛细胞凋亡;Gysemans等［12］发现IFN-γ 与IL-1β 和TNF-α相互作用，通过活化JAK激酶-STAT1信号通路诱导胰岛 β 细胞凋亡;另外，McKenzie等［13］观察到IFN-γ激活细胞毒性T细胞(CTL)，通过释放颗粒酶或Fas/FasL信号，促进胰岛β细胞凋亡，加速Ⅰ型糖尿病的发生。因此，在miR-150KO糖尿病小鼠模型中，α-Galcer处理加速小鼠糖尿病的发生与其IFN-γ产生和分泌增加密切相关。然而，miR-150如何调控NKT细胞IFN-γ的产生和分泌，以及在miR-150KO小鼠中，IFN-γ通过何种分子机制加速STZ处理小鼠糖尿病的发生或发展目前仍不清楚，有待进一步深入研究。

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