抗动脉粥样硬化基因在人主动脉与冠状动脉内皮细胞系的表达

朱诗白，丁文超，刘瑞敏 ，孙伊傥，刘明锁，唐一鸣，李 涛，姬新颖，马远方，白慧玲

（河南大学 免疫学研究所，细胞与分子免疫学重点实验室，河南 开封475004）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是随着人的年龄增长而出现的血管免疫性炎症疾病［1］。与此关联的冠心病在国内平均患病率为6.49%，据此我国有2 000万冠心病患者，对家庭和国家造成非常巨大的经济负担。冠状动脉近侧段之所以好发动脉粥样硬化是由于它比所有器官的动脉都靠近心室，因而承受最大的收缩压撞击。这些部位的血流动力学比较特殊，很可能影响局部血管内皮细胞的基因表达。因此加强血液动力学特点和内皮细胞的基因表达关系的研究，对冠心病的防治具有十分重要的意义［2］。为探讨动脉粥样硬化发生的分子机制，我们总结了50种与动脉硬化的发生密切有关基因，见表2。我们初步检测了人冠状动脉内皮细胞与人主动脉内皮细胞的多种基因的表达，比较其表达差异，检测结果中发现有4种基因在人冠状动脉内皮细胞与主动脉内皮细胞表达明显差异。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人冠状动脉内皮细胞株HCAEC及人主动脉内皮细胞株HAEC（美国ScienCell）及内皮细胞培养基ECM（美国ScienCell），购至上海复蒙生物科技有限公司；实时定量PCR仪RG 6000型（澳大利亚Corbett公司），TRIzol试剂（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），Sybr green PCR试剂盒（北京康为世纪公司），引物合成（北京金唯智公司）。紫外分光光度仪（Beckman公司）。

1.2 方法

1.2.1 人冠状动脉内皮细胞及人主动脉内皮细胞培养 复苏HCAEC及 HAEC，调节细胞密度3×106／mL，用含体积分数为10%胎牛血清 RPMI 1640培养液（Gibco公司）培养，接种于24孔培养板，24h后换用低血清内皮细胞培养基ECM培养液24h，换液后即可用于实验。倒置显微镜下细胞呈单层鹅卵石状生长，台盼蓝染色细胞活力大于97%。

1.2.2 总RNA提取和cDNA的获取 使用TRIzol提取人冠状动脉内皮细胞及主动脉内皮细胞总RNA（具体按试剂说明操作），以DEPC水溶解。按照逆转录试剂盒操作将获得的mRNA转录成cDNA。

1.2.3 半定量RT-PCR检测基因的表达量 将获得的HCAEC及HAEC cDNA稀释至100ng／μl，以β-actin作为内参，反应体系和条件按试剂盒说明书进行。用于4种基因RT-PCR的引物序列，见表1。反应结束后，取反应产物10μL进行10g／L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，在UV-254紫外透射反射分析仪上观察结果，并用数码凝胶成像仪观察电泳结果并摄像，照片进行图像分析。

表1 用于基因RT-PCR的引物序列

2 结果

2.1 5种基因在人主动脉和冠状动脉内皮细胞的表达

RT-PCR结果显示可见 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1、ICAM2的mRNA扩增产物片段分别位于相当与 Mr200bp、260bp、200bp、200bp、100bp的位置，与预期理论值大小一致（图1），产物特异，条带清晰。

2.2 5种基因在人主动脉和冠状动脉内皮细胞的表达差异

根据我们的前期研究工作基础，以及文献检索结果，我们初步判断出50种与动脉粥样硬化发生密切相关的基因（表2），有待进一步的实验验证，而我们检测的4种基因（VEGF、COX-2、ENOS、ZO-1）正是表中总结的抗动脉粥样硬化基因（＋表示），4种基因的表达特点是在人主动脉内皮细胞的mRNA表达水平均高于人冠状动脉内皮细胞，而ICAM2是表2中显示动脉粥样硬化基因，特点是在冠状动脉内皮细胞的表达高于主动脉内皮细胞（图1）。

图1 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1、ICAM2在人主动脉和冠状动脉内皮细胞的表达注：A-HAEC；B-HAC；1-VEGF；2-COX-2；3-eNOS；4-ZO-1；5-ICAM2

表2 我们研究的50种基因在AS中的作用，检索分析结果

3 讨论

动脉粥样硬化是一种炎症性疾病。在粥样斑块中存在许多免疫细胞，而且在不稳定斑块中尤为丰富。近年来对动脉粥样硬化中免疫细胞的聚集、分化和激活有了更深入的了解［3］。流行病学研究发现了多种与其相关的病毒和细菌感染。通过研究初步确定了几个自身性抗原，并提出了自身免疫假说。根据这些新的认识，提出了免疫调节和预防接种等心血管疾病的新的预防和治疗策略［4］。这必将极大地提高对动脉粥样硬化的研究和防治水平。在动脉粥样硬化发生机制中，免疫学说越来越引起人们的重视。研究［5－6］发现免疫细胞在粥样硬化斑块中聚集，说明免疫在动脉粥样硬化发展和转归中也起作用。加强动脉粥样硬化免疫机制的研究，确定动脉粥样硬化的免疫学性质，尤其探索天然免疫在动脉粥样硬化发生早期的作用，有助于彻底阐明动脉粥样硬化的发生机制。

动脉粥样硬化最早的改变为血管内皮细胞功能异常［7］。作用于血管内皮细胞的力有2种：流体对管壁的剪应力（wall shear stress，WSS）和固体周围牵张力（circumferential strain，CS），前者是由血流驱动的，血管长轴平行；而后者则是由血压驱动引起的，是垂直于血管壁的环形张力，作用于血管壁所有细胞。这2种力同时作用于衬于血管的内皮细胞，从而可以调节其表型。在动脉粥样硬化最显著的循环部位如冠状动脉，CS和 WSS是非常不同步的［8］。故认为血液动力学特点与冠状动脉粥样硬化发生密切相关［9］。相对于冠状动脉，主动脉为不易发生粥样硬化的部位，为了探讨主动脉和冠状动脉的血液动力学特点对粥样硬化形成的影响，我们选择检测5种与免疫学相关的基因并比较在主动脉和冠状动脉内皮细胞的表达，四种基因 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1均为我们在初步研究结果的基础上经过检索确定的可能为抗动脉粥样硬化的基因，而我们的检测结果也证实了我们的推测，主动脉内皮细胞较冠状动脉更易表达 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1。而ICAM2为动脉粥样硬化基因，冠状动脉内皮细胞较主动脉内皮细胞高表达ICAM2，可能使其易发动脉粥样硬化。

表2中基因的作用是根据文献检索结果，我们课题组初步确定的，共有“动脉粥样硬化易感基因”21种（－表示），“动脉粥样硬化保护基因”27种（＋表示），另有两种基因APOA与APOB作用尚无确定。我们检测只是我们的初步验证，根据我们的前期研究，我们推测在不同的动脉内皮细胞内有不同的特异基因的表达，在冠状动脉等动脉粥样硬化好发部位，由于血液动力学特点WSS和CS不同步性高，使得两类基因的表达失衡，基因表达呈现动脉粥样硬化性特点；而在主动脉等动脉粥样硬化非好发部位，WSS和CS同步性较好，其基因表达呈现抗动脉粥样硬化性特点。根据预实验结果及文献检索结果［10］我们认为正常情况下，动脉保护性基因与动脉粥样硬化性基因处于平衡状态，而在动脉粥样硬化易发区，平衡易被打破，造成动脉粥样硬化和冠心病，该假设我们将进一步通过体内、体外实验进一步证实并修改。

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［10］姬新颖、李涛、刘瑞敏，等.血流动力学新特点与冠状动脉粥样硬化发生的关系［J］.河南大学学报：医学版，2011，30（4），231－237.