远程缺血后适应对大鼠脑缺血再灌注损伤后MIP-1α表达的影响

王荣亮，赵海苹，罗 玫，张 营，陶 真，闫 峰，罗玉敏

(首都医科大学宣武医院，脑血管病研究室，北京 100053)

脑血管病因其高致残率和高致死率而成为危害人类健康的三大疾病之一。目前，关于脑缺血再灌注损伤机制的研究越来越关注脑组织缺血后的炎症反应。大量实验已经证实，脑缺血后级联的炎症反应是导致脑细胞损伤的重要原因［1，2］，在炎症反应过程中，多种因素相互作用，共同引起再灌注损伤。通过药物及外界手段抑制脑缺血再灌注过程中的炎症反应，减轻脑组织损伤，可能为防治脑缺血疾病提供一条新的有效途径［3］。然而，对于急性缺血性脑血管病患者，目前除了早期溶栓治疗外，几乎没有其他有效的治疗方法。远程缺血后适应(RIPostC)是近些年来发展的一种干预措施，它是在重要生命器官发生缺血后，通过对远程器官重复给予几次短暂的、非致死性的缺血和再通，可以明显减轻再灌注损伤。RIPostC可通过实施于非生命重要器官来保护某些对缺氧缺血极其敏感的生命重要器官(比如脑组织)，并且可以在缺血事件发生之后进行，因此具有非常重要的临床应用价值。已有研究表明，远程缺血后适应对脑损伤有保护作用，而且实施的越早，效果可能越好［4］。

缺血再灌注损伤时促炎细胞因子和趋化因子表达会迅速上调［5－8］，其中单核细胞化学趋化蛋白-l(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory protein，MIP-1α)在脑缺血再灌注后炎症反应的重要作用已引起广泛关注［5，6］。MIP-1α是属于CC亚族的一种趋化性细胞因子，主要由单核/巨噬细胞、中性粒细胞、小胶质细胞产生，趋化单核/巨噬细胞、T淋巴细胞和NK细胞等。近来有不少研究表明，MIP-1α在缺血性脑血管病的再灌注损伤中发挥非常重要的作用［9－12］。MCP-1、MIP-lα 与抗体结合后可促进白细胞迁移，应用受体拮抗剂后，可减少脑梗死体积［10］。Terao 等［13］的研究表明，在脑缺血后 MIP-3α显著增加，脑室注射MIP-3α中和抗体后，可显著减小缺血后脑组织的损伤。这些研究提示，巨噬细胞炎性蛋白可在脑缺血后增加脑组织的损伤，而抑制其表达可使损伤减少。因此，MIP-1α在脑缺血引发的炎症反应中起到非常重要的枢纽作用，可以成为治疗脑缺血的一个新靶点。

1 材料和方法

1.1 动物分组

SPF级雄性SD大鼠77只，体重(280～310)g，购自北京维通利华实验动物公司(动物许可证号:SCXK(京)2008-0001)。恒温条件下饲养，实验前一晚禁食但不禁水。实验前随机分为7组:(1)假手术组(S，n=11);(2)缺血再灌注 8 h组(I8，n=11);(3)缺血后适应8 h组(R8，n=11);(4)缺血再灌注24 h组(I24，n=11);(5)缺血后适应24 h组(R24，n=11);(6)缺血再灌注72 h组(I72，n=11);(7)缺血后适应72 h组(R72，n=11)。

1.2 主要试剂与仪器

小动物呼吸机(Harvard Apparatus 683)、双极电凝(Devel，ACC100)、显微镜(Carl Zeiss)、反馈式温度调节仪(Harvard Apparatus)、血气分析仪(Abbott，i-STAT)、有创血压监测仪(Siemens SC600C)、显微手术器械、生物安全柜(Labconco Class II Type A2)、PCR仪(MJ Research)、电子天平(Adventurer)、超声波细胞粉碎机(Scientz-IID)、离心机(Thermo)、酶标仪(Multiskan MK3，Thermo)、MIP-1α 抗体(Santa Cruz Biotechnology，sc-33203)、HRP标记的山羊抗兔抗体(北京中杉金桥生物科技公司)、ECL发光液(Millipore)、NC 膜 (Pall)、化 学 发 光 仪(ChemiScope)、免疫荧光显微镜(Nikon digital imaging hero eclipse 80i)、摇床(TS-1/TS-8)。

1.3 动物模型的制备

大鼠称重后用4%恩氟烷诱导麻醉，应用小动物呼吸机及麻醉机，1% ～2%恩氟烷混合70%N2O和30%O2维持麻醉，术中监测肛温、血糖、血气及血压，各项指标维持在正常范围。选择右侧大脑中动脉，所应用的线栓(北京沙东生物技术有限公司)头部直径为0.38 mm，将其插入颈内动脉，至距颈内动脉和颈外动脉分叉处约1.8 cm～1.9 cm。栓塞2 h后拔出栓子制备缺血2 h再灌注损伤模型，分别于再灌注后8 h、24 h和72 h处死大鼠，断头取脑，以备石蜡切片制作以及脑组织蛋白的提取用。假手术组做钝性分离，插入线栓后立即拔出，脑组织无缺血损伤。

1.4 远程缺血后适应方法

如之前所述，有研究表明:远程缺血后适应实施的越早，对脑保护的效果可能越好［4］。我们之前已研究过缺血2 h后给予后适应所起到的神经保护作用［14］，为了具体研究其作用机制，我们采取缺血即刻后适应，方法如下:分离大鼠双侧股动脉主干，在大鼠脑缺血即刻夹闭双侧股动脉10 min，放开10 min，如此共进行3个循环。

1.5 石蜡切片的制备

将假手术组(n=4)和实验组8 h(n=4)、24 h(n=4)和72 h(n=4)分别于再灌注后8 h、24 h和72 h后用10%水合氯醛腹腔麻醉，右心房快速灌注肝素化PBS及4%多聚甲醛进行固定，断头取脑，除去嗅球和小脑，置4%多聚甲醛中后固定48 h后放入模具，于视交叉处沿冠状切片，向前囟方向切2张切片，向小脑方向切3张切片，每片厚约2 mm，石蜡包埋。

1.6 荧光定量RT-PCR检测

首先进行总RNA提取，冰上分离大鼠皮层，加入含一定量TRIzol的研磨器中，反复研磨匀浆。室温放置5 min后，每1 mL TRIzol中加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置3 min。12 000 r/min 4℃离心15 min，将上层的水相吸至新的离心管内，加入0.5 mL的异丙醇，室温放置10 min，于4℃ 以小于12 000 r/min转速离心10 min。弃去上清液，用1 mL 75% 的乙醇清洗沉淀，于4℃ 以7 500 g转速离心5 min，用微量移液器尽可能将乙醇吸尽，随后于室温放置5～10 min，使残留乙醇挥发干净。用DEPC处理的去离子蒸馏水20 μL溶解沉淀，测A260、A280值，计算A260/A280比值，估算样品中RNA的含量和纯度。用DEPC处理的去离子蒸馏水调整样品终浓度为 1 μg/μL，置于 －80℃ 冰箱保存。

cDNA的合成:将以下成份加入经DEPC处理的200 μL EP 管内。(500 μmol/L 随机引物 1 μL;10 μm dNTP 2 μL;1 μg/μL 细胞总 RNA 2 μL;用DEPC处理的去离子蒸馏水补至12 μL。65℃变性5 min后即刻冰浴，加入5×first chain缓冲液4 μL、0.1 M DTT 2 μL、40 U/μL RNase 抑制剂 1 μL，混匀。37℃加热5 min。加10 U/μL逆转录酶M-MLV 1 μL，混匀，37℃加热 50 min。70℃灭活 15 min，反应物保存于－20℃冰箱备用。荧光定量PCR检测MIP-1α合成的引物:正向 5'-GCGCTCTGGAA CGAAGT-3'，反向 5'-GCAAAGGCTGCTGGTCT-3'。

PCR 反应条件:a．反应体系为 25 μL，其中MIP-1α选用2×GC II缓冲液，GAPDH选用10×缓冲液:2 ×GC II缓冲液12.5 μL、10 mM dNTP 2 μL、20 μM 引物:SN 0.5 μL、ASN 0.5 μL、cDNA(1 μg/μL)1 μL、Taq 酶 1.25 μL、加双蒸水至 25 μL、10 ×缓冲液:10 mM dNTP 2 μL、20 μM 引物:SN 0.5 μL、ASN 0.5 μL、cDNA(1 μg/μL)1 μL、Taq 酶 1.25 μL、加双蒸水至25 μL。b．扩增反应条件:①预变性:95℃ 5 min。②变性:95℃ 30 s;退火:MIP-1α 55℃ 30 s，GAPDH 54℃ 30 s;延伸:72℃ 1 min。③循环数:最佳退火温度和反应循环数因扩增的目的基因片段而异。分别于第20、22、24…38、40个循环各取出一管反应产物，取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳，对目的带光密度扫描定量，以光密度值-循环数作曲线，选择PCR反应达平台期前的指数增长期循环数确定为半定量PCR的反应循环数。MIP-1α循环数为32，GAPDH循环数为26。④72℃延伸30 s，72℃延伸1 min。⑤4℃保存。琼脂糖凝胶电泳:制备1%琼脂糖凝胶，EB染色。凝胶完全凝固后，小心移去梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面约1 mm深的足量1×TBE电泳缓冲液。吸取DNA样品各5 μL与所需加样缓冲液(loading buffer)混合，用一次性微量移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。盖上电泳槽并通电，使DNA向阳极移动。100 V稳压电流电泳20 min左右。切断电源，从电泳槽上拔下电线，打开槽盖。在紫外灯下自显影并照相。应用GEL-PRO analyzer 2.0分析软件对各目的条带的光密度值(A)进行分析，计算各目的基因的相对表达水平(相对表达水平=A目的基因/A内对照基因)。

1.7 免疫印迹法检测

将假手术组(n=4)、缺血再灌注组和缺血后适应组8 h(n=4)、24 h(n=4)、72 h(n=4)分别于再灌注后8 h、24 h和72 h处死大鼠，取梗死侧皮层脑组织置于冰上，称重后加入5倍的裂解液，将样品用小剪刀剪碎，在冰水浴中用超声波细胞粉碎机进行匀浆后，冰浴 30 min，12 000 r/min 4℃离心 30 min，取上清液。在酶标仪上用BCA法参照标准蛋白浓度，于560 nm处测定样本的吸光度值(A值)。根据蛋白定量的标准曲线计算各样本的蛋白含量。

配制15%分离胶和5%积层胶，取180 μg蛋白样品溶于相应体积的上样液中，水浴锅98℃加热5 min，蛋白变性后即刻加样。室温下40 V电泳1 h，蛋白样品到达分离胶后将电压调为80 V，继续电泳约1.5 h。配制电转液，冰浴中60 V 30 min电转。将电转后的NC膜置于TBST中清洗3次，每次5 min，置入8%脱脂牛奶中4℃封闭过夜。第2天将膜置入一抗中室温孵育4 h，随后TBST清洗3次，每次5 min，再置入二抗中室温孵育1 h。抗体如下稀释:抗 MIP-1α(1∶200)、抗 actin(1∶2 000)、HRP标记山羊抗兔(1∶2 000)。与二抗反应好后，将膜置于ECL发光液中3 min，放入化学发光仪进行检测。得到的结果用Quantity one 4.4.0软件分析蛋白条带的相对灰度。

1.8 免疫荧光染色

依次进行脑组织切片的二甲苯脱蜡、梯度酒精入水，0.3%的H2O2/甲醇溶液消除内源性过氧化物酶活性，EDTA抗原微波热修复12 min，小牛血清封闭非特异性抗原，4℃过夜;加1∶200稀释的MIP-1α抗体，室温2 h;1×PBS(pH=7.4)漂洗3次，每次3 min;加TRITC山羊抗兔IgG，室温孵育30 min;1×PBS(pH=7.4)漂洗3次，每次3 min;DAPI封片，荧光显微镜下观察。

1.9 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有资料用平均值±标准差(ˉ±s)表示，各数据组间比较使用one-way ANOVA方法，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 远程缺血后适应对大鼠脑缺血 MIP-1α mRNA含量的影响

图1和图2分别为荧光定量RT-PCR检测的大鼠脑缺血核心区和半暗带区MIP-1α mRNA表达的结果。从图1中可见，在缺血核心区，单纯缺血组MIP-1α mRNA的表达缺血再灌注组高于S组，8 h达高峰，24 h时之后持续下降。缺血后适应组MIP-1α mRNA的表达变化趋势与缺血再灌注组相同。经统计分析，其中I8组与S组间比较有统计学意义(P＜0.05)，R8组和R24组与S组相比有统计学意义(P＜0.05)。

从图2中可见，在缺血半暗带区域，MIP-1α mRNA表达的变化趋势与缺血核心区相似，其中I8组与S组相比较有统计学意义(P＜0.05)，而其他组间比较无统计学意义。

图1 大鼠脑缺血梗死核心区MIP-1α mRNA表达水平(s)Fig．1 The mRNA level of MIP-1α expression in the cerebral ischemic core(±s)

2.2 远程缺血后适应对大鼠脑缺血皮层区MIP-1α蛋白含量的影响

图3为免疫印迹法检测的大鼠MIP-1α蛋白表达结果和统计图。与S组相比，随着缺血再灌注时间延长，I组及R组MIP-1α蛋白的表达均有所增加，其中I24 h和I72 h显著增加，有统计学意义，P＜0.05。与I组相比，R24 h和 R72h组MIP-1α的表达下降，与I 72 h相比，R72 h组MIP-1α的表达下降显著，接近于 S组，有统计学意义，P＜0.05。其余各组间比较无统计学意义。

2.3 免疫荧光结果

图2大鼠脑缺血半暗带区MIP-1α mRNA表达水平ˉ±s)Note:Sham;I/R:MCAO model;I/R+R:MCAO+RIPostC．Fig．2 MIP-1α mRNA level in the cerebral ischemic penumbra±s)

图3大鼠脑缺血皮层区MIP-1α蛋白的表达水平±s)Fig．3 MIP-1α protein level in the cerebral ischemic cortex

图4(见文后彩插1)为大鼠脑组织在缺血72 h后皮层区MIP-1α的免疫荧光染色结果图。缺血再灌注72 h后，I72 h组MIP-1α的表达水平显著增加;相比较而言，给予远程缺血后适应干预的R72 h组表达降低，接近sham组水平。免疫荧光的结果与Western blot的结果相符。

3 讨论

本文主要是探讨远程缺血后适应对大鼠脑组织MIP-1α mRNA和蛋白水平表达的影响，为远程缺血后适应的研究提供一定的理论基础。本研究表明，与S组相比，缺血模型组及远隔缺血后适应组MIP-1α mRNA均有不同程度地升高，均在缺血再灌注后8 h时达到峰值，有统计学意义。Schmidt-Kastner R 等［7］发现，在大鼠短暂缺血3 h后，MIP-1α mRNA 水平即开始升高。Sieber等［15］和 Nishi等［6］在用小鼠模型研究中发现，MIP-1α mRNA在缺血再灌注后6～12 h显著增加，12 h达到最高值。这与本研究的缺血再灌注组(I组)结果相符，梗死核心区及缺血半暗带MIP-1α mRNA的水平均在缺血8 h后达到最高，随后开始下降。结果表明，远程缺血后适应不能降低缺血核心区的MIP-1α mRNA表达水平，在缺血半暗带可一定程度上降低MIP-1α mRNA水平，但无统计学差异。另外，在本研究中，MIP-1α蛋白在缺血再灌注24 h后达到高峰，这与Nishi等［6］的研究结果相符。缺血后各组的MIP-1α蛋白表达均有所增加，与 S组相比，缺血模型组MIP-1α在缺血再灌注24 h和72 h后显著增加，有统计学差异;值得注意的是，在缺血再灌注72 h组中，相对缺血模型组，远程缺血后适应组MIP-1α表达水平显著降低，有统计学差异。以上结果提示MIP-1α参与了大鼠脑缺血再灌注损伤的炎症反应，而远程缺血后适应可能通过减轻炎症反应而发挥脑保护作用，这在再灌注损伤的晚期较为明显。但由于实验没有涉及到72 h后的时间点，无法验证RIPostC在脑缺血再灌注后更长时间的保护作用，这也是本研究的不足之处。

之前已有研究表明，肢端缺血预处理(limb ischemic preconditioning，LIP)可抑制炎症因子的表达，减轻脑缺血后炎症反应，从而对脑组织起到保护作用［16］。本研究采用的是远程缺血后适应是在缺血后采取的干预，因此，拥有更好的临床应用前景。进一步研究其作用机制，发挥神经元保护作用而拮抗其致炎效应，可能是今后防治脑缺血的一条新的有效途径。

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