利用TALENs技术制备瘦素基因敲除的大鼠

关菲菲，张 旭，陈 炜，董 伟，高 凯，张连峰

(中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

瘦素(leptin)是一个主要由白色脂肪组织分泌的细胞因子［1］，其与中枢神经系统的瘦素受体结合能够启动调节摄食和机体能量平衡，当瘦素缺失或者受体缺失，会导致肥胖发生［2］。瘦素曾经被期望作为一种治疗肥胖的药物，但研究发现，其仅对于本身缺少瘦素或者脂肪代谢障碍的个体有效，而普通的肥胖患者，由于产生瘦素抵抗，而失去功效［3－6］。尽管对瘦素的研究已经开展了很多年，但是很多机制还有待阐明，包括对免疫、神经等方面的调节，特别是对人类而言，如脂肪组织合成和释放瘦素的生理调控，瘦素与胰岛素的关系［7］，瘦素抵抗等［8－10］，该基因仍然是研究的热点之一。由于大鼠的生理和解剖特点，其在生理、代谢、神经系统等方面比小鼠有更好的表现［11，12］。所以，建立leptin敲除大鼠可以用于代谢、神经系统研究，有助于更好的理解该基因的功能和参与疾病发生的机制。大鼠的ES细胞全能性不好，使基于大鼠ES细胞的传统基因打靶技术在大鼠的基因敲除中仍然没有商业化。随着锌指酶(ZFN)和类转录激活因子效应因子核酸酶(TALENs)等技术的不断完善，使大鼠基因敲除实用化［13－15］。TALENs是由来自于植物病原菌黄单孢菌的类转录激活因子效应因子(Tale)和核酸内切酶Fok I的催化区域融合而成的融合基因，保留了类转录激活因子效应因子DNA特意识别功能和Fok I的DNA酶活性，识别特异的DNA序列并将其剪切形成双链缺口，通过非同源末端连接修复该缺口造成 DNA 片 断 的 插 入 或 缺 失［16－18］。TALENs 与ZFN相比具有识别位点更广泛和剪切效率更高的优点［19］。

本文报告了利用TALENs技术建立了leptin基因敲除的SD大鼠品系，并对该基因敲除大鼠进行了体重、脂肪含量、糖代谢等分析。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SD大鼠购自军事医学科学院实验动物中心(SCXK(军)2007－004)，在本实验室无特定病原体(specific－pathogen free，SPF)的饲养间(SYXK(京)2009－0003)饲养，本实验方案已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为 ILAS－GC－2012－001。

1.2 TALENs载体的构建和体外转录

左右靶点的识别模块经golden gate方法组装完成后，分别克隆到真核表达载体pST1374和pC3．1－Huang上完成TALENs载体对的构建。线性化后，在T7启动子的作用下体外转录为mRNA(AM1345，Ambion)用于大鼠的原核注射。注射用的两种mRNA经注射缓冲液稀释为终浓度20 ng/μL。剪取经原核注射产生的5～7日龄首建鼠的鼠尾组织，提取基因组DNA，利用引物扩增目的片段，PCR上游 引 物 s1 为:5＇－GAAGGTGAGAAGGAGAGAGG CAG－3＇，下游引物 a1 为:5＇－GGTGGAACACGGAGG GGAC－3＇，对扩增出的PCR产物过柱纯化(D822A，Takara)，取200 ng纯化后的PCR产物，经T7EN1酶切，2%琼脂糖电泳，选择能够被酶切开的PCR产物进行TA克隆，测序，与野生型SD大鼠基因目的序列比对，分析靶点序列缺失情况。

1.3 Leptin敲除大鼠的PCR检测方法

利用两对引物s2，a2和s3，a3，鉴定 leptin敲除大鼠的基因型，上游引物 s2:5＇－GGAAGCCTCGC TCTACTCCACA－3＇，下 游 引 物 a2:5＇－GTCCTGG AAGCCTCGCTCTGA－3＇，扩增条带 501 bp;上游引物s3:5＇－TGTGCAGATGTAGCCTTCATGGTG－3＇，下游引物 a3:5＇－GTCCTGGAAGCCTCGCTCTGA－3＇，扩增条带493 bp;如果鼠尾基因组PCR仅扩增出501 bp条带，为野生型(+/+);仅扩增出493 bp条带，为纯合子(－/－);若同时扩增出501 bp和493 bp条带，则是杂合子(+/－)。

1.4 体重及脂肪重量测定

从4周龄开始，每周定期测定大鼠体重，到4月龄时，2%戊巴比妥纳麻醉牺牲大鼠，小心剥离皮下脂肪和腹腔脂肪，并称重。

1.5 血生化指标测定

大鼠禁食过夜，收集外周血，室温放置1．5 h后，3 000 r/min，15 min，4°离心，获取血清，利用血生化分析仪(Hitachi 7100 Automatic Analyzer)进行甘油三酯、胆固醇、高密度胆固醇及低密度胆固醇的测定。

1.6 腹腔葡萄糖耐受实验及葡萄糖刺激下的胰岛素水平

待测大鼠称重，禁食过夜(不禁水)，腹腔注射40%葡萄糖溶液(1 mg/g)，注射前剪尾测定血糖值，计为0时，并分别在注射后第30、60、90、120分钟测定血糖值。血糖值是利用稳豪血糖仪测定。在以上测定时间点，测定血糖的同时，采集100 μL外周血，室温放置1．5 h 后，3 000 r/min，15 min，4℃离心，获取血清，利用大鼠/小鼠胰岛素ELISA检测试剂盒(Millipore)测定血清中胰岛素含量。

1.7 MRI成像

MRI成像采用Varian公司生产的7T/160 mm孔径的小动物磁共振成像系统，将动物用2%异氟烷与氧气混合气进行麻醉，用体线圈进行采集和接收，采集过程中用呼吸门控控制信号的采集［20］。选择SE(自旋回波序列)T1WI分别对leptin－/－大鼠和leptin+/+大鼠进行冠状位和横断位扫描。冠状位扫描参数:TR(重复时间)/TE(回波时间)230 ms/16 ms;FOV(视野)70 mm×45 mm;层厚1 mm;层间距1 mm;叠加次数4;扫描矩阵256×256;总扫描时间3 min 55 s。横断位扫描参数:FOV40 mm×45 mm，其它参数相同。

1.8 组织学观察

2%戊巴比妥钠麻醉牺牲大鼠，打开腹腔取出胰腺将其固定在10%中性甲醛溶液中24 h，脱水，石蜡包埋及切片，HE染色后显微镜下观察(Leica显微镜，德国)病理学变化。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 Leptin敲除大鼠的构建及PCR鉴定

根据大鼠leptin核酸序列信息，针对外显子3设计两处相邻(间隔20个碱基)的靶序列进行TAL识别模块构建，将这两个相邻靶点识别模块融合克隆到 FokI的 N－末端，形成真核表达载体，得到TALENs质粒对(图1a)。将TALENs质粒对共同原核注射到SD大鼠的0．5 d受精卵中，移植到SD假孕鼠子宫内，共出生11只幼仔，剪取5～7日龄的鼠尾组织，提取基因组DNA，PCR扩增，测序与野生型大鼠瘦素基因序列比较，其中一个首建大鼠在leptin编码区418～425位共8个碱基的缺失，产生了TGA终止密码子(图1b)，导致该蛋白C末端缺失了28个氨基酸(图1c)。杂合子大鼠leptin+/－互交得到纯合敲除大鼠leptin－/－(图1d)。

图1 Leptin－/－大鼠的TALEN设计及PCR鉴定Fig．1 Design and assay of TALENs that target the rat leptin locus and their PCR verification

图2 Leptin－/－大鼠的体重曲线及脂肪分布Fig．2 The body weight curves of leptin－/－ rats and the quantitative analysis of fat tissue

2.2 Leptin敲除大鼠的体重曲线及脂肪分布

从出生后4周龄始至4月龄，测定leptin+/+和leptin－/－大鼠的体重。从5周龄开始，leptin－/－大鼠体重显著高于leptin+/+大鼠，2月龄时，体重比leptin+/+大鼠增加35%，到4月龄时，比leptin+/+大鼠增加52%(图2a)。麻醉处死4月龄大鼠，剥离皮下及腹腔脂肪并称重，证实Leptin－/－大鼠的皮下和腹腔脂肪的重量分别是leptin+/+大鼠的20倍和4倍(图2b)。MRI结果也观察到leptin－/－大鼠皮下和腹腔脂肪积累的增加(图2c)。同时，leptin－/－大鼠的血清中甘油三酯和胆固醇含量分别是leptin+/+大鼠的8．4倍和1．8倍(表1)。

表1 4月龄leptin－/－大鼠和leptin+/+大鼠的基础血生化(n=5)Tab．1 Blood biochemical parameters of the leptin－/－ and leptin+/+rats(n=5)

2.3 Leptin敲除大鼠的糖耐受曲线及葡萄糖刺激的胰岛素水平曲线

4月龄时，对leptin－/－大鼠进行糖耐受实验，分别在注射葡萄糖后的第30、60、90、120分钟采血，测定血糖值和胰岛素含量。测定结果显示:在过夜空腹16 h后，leptin－/－大鼠和leptin+/+大鼠的空腹血糖差异没有显著性，以此数值记为0 min取值，随后按体重腹腔注射葡萄糖，发现在注射后的第60分钟，leptin－/－大鼠的血糖比leptin+/+大鼠增加了 65%(13．4 ± 1．7 mmol/L vs．8．1 ± 1．4 mmol/L)(P ＜0．05)，第90分钟，血糖比leptin+/+大鼠增加了85%(12．4 ±1．6 mmol/L vs．6．7 ±0．9 mmol/L)(P＜0．05)，第 120分钟时，血糖比 leptin+/+大鼠增加了77%(11．0 ±1．5 mmol/L vs．6．2±0．2 mmol/L)(P ＜0．01)(图 3a)。相应时间点的血清胰岛素含量显示，空腹0时，leptin－/－大鼠胰岛素含量是 leptin+/+大鼠的 39倍(11．8±1．2 ng/mL vs 0．3 ±0．1 ng/mL)(P ＜0．001)，具有明显的高胰岛素血症，当注射葡萄糖后的第30分钟，leptin－/－大鼠胰岛素含量是leptin+/+大鼠的7．9 倍(19．3 ±1．6 ng/mL vs．2．4 ± 0．4 ng/mL)(P＜0．001)，第60 分钟，是 leptin+/+大鼠的17．6 倍(21．1 ± 3．0 ng/mL vs．1．2 ± 0．3 ng/mL)(P ＜0．001)，第 90分钟，是 leptin+/+大鼠的 20倍(22．4 ± 0．9 ng/mL vs．1．1 ± 0．2 ng/mL)(P ＜0．001)，第 120分钟，是 leptin+/+大鼠的 22倍(22．8 ± 3．4 ng/mL vs．0．9 ± 0．2 ng/mL)(P ＜0．01)(图3b)。将2月龄大鼠麻醉处死，取胰腺，4%中性甲醛溶液固定后，石蜡切片，HE染色，显微镜下观察，发现leptin敲除纯合子大鼠的胰腺组织里有明显增生的胰岛(图3c，d)，这可能是敲除大鼠有明显高胰岛素血的原因(图3见封三)。

3 讨论

Leptin是由obese(ob)基因编码，分子量为16 kD的一种细胞因子，主要由白色脂肪组织分泌，在饮食调节、能量平衡、糖和脂类代谢、炎症反应、免疫调节、神经再生、血管愈合、癌症发生等多方面起到重要作用，参与包括糖尿病、心血管疾病、呼吸系统疾病、癌症、阿尔茨海默症等多种疾病的发生发展［21－24］。截止到2012 年底，已有 22 000 篇文献对leptin的多种生物学功能进行了报道［25］。尽管如此，有些作用仍不明确，如体外实验证实，leptin是脂肪组织中巨噬细胞聚集的趋化剂，增加了前炎症因子的分泌，引起了脂肪组织的炎症，这种作用是通过 leptin受体完成的［26，27］，然而体内试验否定了这个作用，试验者未观察到高脂饲料饲喂下leptin受体缺失的小鼠与正常小鼠脂肪组织中的巨噬细胞的差异［28］。由于leptin对机体的重要作用，构建leptin缺失的动物模型将有助于更好的揭示其作用机制。

1949年美国杰克逊实验室发现的一种隐性遗传的leptin自发突变小鼠(ob/ob)，是在基因编码区的第105位发生了C到T的无义突变，蛋白在C末端缺失了133个氨基酸。突变基因纯合子小鼠表现为摄食过度、肥胖、葡萄糖耐受、高血浆胰岛素水平、不孕不育［29－30］。

2012年，Serglo Valra等［31］利用 ZFN 技术获得了一种leptin敲除大鼠，是在该基因外显子1和内含子上发生了151个碱基片断的缺失，leptin蛋白无法正常表达。该纯合子大鼠出现摄食增加，肥胖，血清中总胆固醇、高密度和低密度胆固醇显著增加，有明显的高胰岛素血和糖耐受受损。

本实验室利用TALENs技术获得了一种leptin基因敲除大鼠，测序发现是在leptin基因编码区的第418～425位有8个碱基的缺失(外显子3)，并形成了TGA终止子，蛋白C末端缺失了28个氨基酸。该leptin－/－大鼠5周龄时体重显著高于leptin+/+大鼠，4月龄时，体重比野生大鼠增加达52%，脂肪大量积累在皮下和腹腔中，且皮下脂肪积累更多，血清中甘油三酯和总胆固醇含量较野生大鼠显著增加，leptin－/－大鼠的血清中甘油三酯和总胆固醇含量分别是 leptin+/+大鼠的8．4倍和1．8倍，并有明显的糖耐受受损和高胰岛素血。该敲除大鼠的获得说明了C末端28个氨基酸序列对于leptin行使功能非常重要。由于leptin在炎症反应、免疫调节、神经再生、血管愈合、癌症发生等多方面的重要作用，该大鼠预期可以成为肥胖、糖尿病、高血脂等疾病模型，也可以更好的探讨leptin在神经、免疫、癌症等方面的作用。

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