大鼠物体识别实验装置的研制

宋广青，高 莉，孙秀萍，王 逸，武宏伟，李海清，刘新民

(1．中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所药理毒理中心，北京 100193;2．新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所，乌鲁木齐830049;3．中国医学科学院北京协和医学院医学实验动物研究所，北京 100021;4．北京鑫海华仪科技有限公司，北京 100193)

物体识别实验(object recognition task，ORT)［1］是一种精细、敏感的行为学检测方法，以其独特的优势近年来得到了广泛的应用。该实验方法利用啮齿类动物天生喜欢接近和探索新奇物体的本性［2］为原理，即当一个新奇物体和一个先前遇到过的物体同时出现时，啮齿类动物会花费更多的时间对新奇物体进行探索;无需给实验动物食物诱导或不利刺激［3］。物体识别实验是一种一次性的学习实验模式，研究者可以对记忆的习得、巩固和消退［4，5］阶段分别进行精细化研究。物体识别实验被广泛用于记忆神经生物学研究、脑损伤机制研究［6］以及认知障碍防护措施研究［7，8］等多个方面。

近年来，物体识别实验被国际科学界作为一种对动物学习记忆、益智药效研究和记忆机制研究的新方法而受到广泛应用和重视。目前，用于物体识别实验的装置基本上都是直接暴露于外界环境中，不能避免外界干扰对动物行为的影响。为了更好的模拟自然环境提高实验结果的准确性，我们实验室在传统检测装置的基础上对大鼠物体识别实验装置进行了改进。本文主要介绍了新研制的大鼠物体识别实验装置，并对新装置的可行性进行了部分验证。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 测试装置所需材料:计算机(Pentium 2.4 GHz，内存:1 G，硬盘:80 G，显卡:Geforce 4 MX 440);I/O卡;Visual C++可视化软件开发工具(微软公司);复杂可编程逻辑器件(CPLD，Xilinx公司)，接口芯片(PLX公司);LED灯;彩色摄像头;金属材料、PVC材料、磁铁;电路板;数字式照度计［TES-1330A］。

1.1.2 实验动物:SPF级Wistar大鼠，雄性，6周龄和10周龄，体重(230±10)g和(340±10)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2012-0001】。动物充足的食、水，进行适宜性喂养，实验室安静，温度24°C，12 h照明/12 h黑暗环境(8:a．m．开灯)。动物实验遵守国际实验动物伦理学要求。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠物体识别实验装置的研制:参考综述文献［3］和相关学科技术，设计大鼠物体识别实时监测装置和物体。封闭测试箱整体尺寸:长60 cm、宽40 cm、高80 cm。物体:(1)橘红色铁制圆柱体(底径5 cm，高10 cm);(2)橘红色铁制三角锥体(底边5c m，高10 cm);(3)蓝色铁制圆柱体(底径5 cm，高10 cm);(4)蓝色铁制三角锥体(底边5 cm，高10 cm)，每套物体有3个/每个测试箱。

大鼠物体识别实验装置设计见图1。(所用传统装置的测试箱是一个矿场装置，测试箱整体尺寸:长60 cm、宽40 cm、高40 cm，摄像头以一定距离悬于上方，材料与封闭装置完全相同，由实验室顶部灯管提供光照)

大鼠物体识别实验封闭装置测试箱体两侧中间位置装有两排LED灯，箱体内光强度可人为进行调节;箱体顶部装有一彩色摄像头;箱体内部使用黑色PVC材料，箱底板喷以黑色哑光漆并用砂纸打磨以避免反光，在距离侧壁10 cm对称位置处装有磁铁用于固定两个物体，底板可抽出便于清洗动物残屑物。计算机可对测试箱内部进行实时监测。大鼠物体识别实验封闭装置及物体见图2。

1.2.2 动物分组:将大鼠随机分为:敞口组、(230±10)g组(封闭组)、(340±10)g组。

图1 大鼠物体识别实验装置设计示意图Fig．1 Diagram of the apparatus for object recognition task in rats

图2 大鼠物体识别实验装置实物图Fig．2 The apparatus for object recognition task in rats

1.2.3 物体识别实验程序的建立:选用一个测试箱(封闭或敞口)进行实验，用于实验的两套物体:橘红色铁制圆柱体、橘红色铁制三角锥体，调节测试箱内光强度为30～40 Lux。适应性喂养3 d后，开始连续2 d的抓、摸适应过程，实验人员每天用手抓、摸大鼠尾部及身体约3 min/只。适应期:第6天将大鼠依次放入没有任何物体的测试箱中让其自由活动3 min，连续2次。检测实验:检测实验发生在适应期的第2天，包括2个阶段-熟悉期和测试期，每一阶段实验时间5 min，检测实验进行前将大鼠依次放入测试箱中再次适应，3 min/只，以便使测试箱中浸满气味;熟悉期时在测试箱内底板上距离侧壁10 cm的磁铁处放入两个相同的物体，将大鼠以背对物体的方式放入测试箱中，待实验结束时将大鼠重新放入饲养笼;间隔1 h后进入测试期，测试期时在测试箱内放入两个不同的物体(一个与熟悉期物体完全相同称为“熟悉物体”，另一个不同的物体称为“新奇物体”)。物体的使用(熟悉物体或者新奇物体)在实验动物中要平衡，即一半的动物以圆柱体作为熟悉物体，另一半的动物以三角锥体作为熟悉物体;测试期两个物体的位置要随机置换。熟悉期和测试期时，动物对两个物体的探索时间分别由同一实验员通过计算机屏幕用两个秒表记录。每只动物实验结束时用纸将其残泄物擦拭干净再开始下一只动物实验，避免大鼠在实验时被物体之外的东西吸引而影响实验结果，每天实验结束后用蘸有70%酒精的棉球擦拭底板和物体［7］。

大鼠对物体的探索活动定义为:大鼠的鼻子在≤2 cm的范围指向物体或者用口鼻部直接嗅、舔物体。当大鼠坐在物体上或身体其他部位接触物体而鼻子没有指向物体时都不被认为是对物体的探索活动。

物体识别实验中用于表示物体探索和辨别的相关指标见表1:

表1 物体识别实验中用于表示物体探索和辨别的实验指标Tab．1 Exploration measures used to indicate the performance in the object recognition task

物体识别实验中最基本的指标是动物在熟悉期和测试期对两个物体的探索时间(s)。熟悉期时动物对两个相同物体的探索时间分别用Tf1、Tf2表示，测试期时动物对熟悉物体和新奇物体的探索时间分别用Tf和Tn表示。由这些探索时间，可以推导出以下指标:e1=Tf1+Tf2，e2=Tf+Tn，d1=Tn–Tf和d2=d1/e2(表1)。e1和e2分别表示熟悉期和测试期时大鼠对两个物体的探索总时间。d1和d2被当做是辨别出熟悉物体和新奇物体的指标。d2是一个相对辨别指标，考虑到了动物之间不同的探索活动水平。d2的范围是－1～1，－1表示动物在测试期时完全偏爱熟悉物体，0表示动物在测试期时对熟悉物体和新奇物体的探索时间相同无物体偏爱性，1表示动物在测试期时完全偏爱新奇物体。

1.3 统计学方法

采用统计软件 SPSS 16.0进行统计分析，数据以均数±标准误(ˉ±s)表示。组内评价Tf和Tn是否不同用配对t检验(paired-samples t test)进行分析。组间比较 e1、e2、d1和d2用独立样本 t检验(independent-sample t test)。另外，用单样本t检验(one-sample t test)比较每组d2与0的显著性，当存在差异显著性时表示该组动物在测试期实验时能够辨别出熟悉物体。以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 封闭和敞口装置中大鼠物体识别实验结果的比较

2.1.1 每组大鼠物体辨别能力:图3显示两组大鼠测试期时(间隔1 h)对新奇物体探索时间(Tn)显著高于对熟悉物体探索时间(Tf)(P＜0.01，P＜0.05)。相对辨别指数d2与0比较时只有封闭组有显著性差异(P＜0.01)。

2.1.2 两组大鼠探索水平和物体辨别能力的比较:图4显示封闭组和敞口组大鼠测试期探索总时间(e2)差异存在显著性(P＜0.05);封闭组相对辨别指数d1与敞口组相比差异存在显著性 (P＜0.05)。两组熟悉期探索总时间(e1)之间及绝对辨别指数d2之间比较差异无显著性。

2.2 两种常用体重正常大鼠在封闭装置中进行物体识别实验结果的比较

2.2.1 每组大鼠物体辨别能力:图5显示 在封闭装置中两种不同体重大鼠测试期时(间隔1 h)对新奇物体探索时间(Tn)都显著高于对熟悉物体探索时间(Tf)(P＜0.01)。相对辨别指数d2与0比较，两组差异都具有显著性 (P＜0.01，P＜0.05)。

2.2.2 两组大鼠探索水平和物体辨别能力的比较:图6显示(230±10)g组熟悉期探索总时间(e1)显著高于(340±10)g组(P＜0.01);(230±10)g组相对辨别指数d1与(340±10)g组相比差异存在显著性(P＜0.01)。两组测试期探索总时间(e2)之间及绝对辨别指数d2之间比较差异无显著性。

图3 封闭组和敞口组大鼠的物体辨别能力Fig．3 Object recognition ability of the rats tested with the closed apparatus or open-field apparatus

图4 封闭和敞口装置中大鼠探索时间及相对辨别指数的比较Fig．4 Comparison of the exploration time and absolute discrimination index d1，respectively，between the closed and open-field groups

图5 230±10 g和340±10 g两组大鼠各自的物体辨别能力Fig．5 Object recognition ability of the 230±10 g and 340±10 g rats

图6 两组不同体重大鼠探索时间及相对辨别指数的比较Fig．6 Comparison of the exploration time and absolute discrimination index d1，respectively，between the 230 ±10 g and 340 ±10 g rats

3 讨论

物体识别实验主要用于检测哺乳动物的陈述性记忆［9］，自 1988 年被 Ennaceur和 Delacour提出后就得到了广泛的应用。较其他记忆检测任务，该实验方法具有很多优势，如只需要较少的训练，引起的应激及情绪激发较小［10］。另外，物体识别不但可以用于检测动物的非空间记忆能力还可用其他多种模式对动物的空间记忆能力、物体背景信息和物体顺序等进行检测，实现精细化研究。因此，物体识别将在动物行为学研究中日益重要。

物体识别实验程序简单明确易操作，便于该方法在不同实验室中的建立。尽管物体识别实验在啮齿类动物中得到了广泛应用，但是在该方法实施过程中不同实验室有各自的版本。目前，进行大鼠物体识别实验的装置都是不同尺寸或不同材质的矩形或方形的实验箱［3］，少数是圆形或Y型实验箱［10－12］，这些传统的实验装置都是敞口的，直接暴露于外界环境中，不能避免外界因素对实验的影响。我们实验室以传统敞口装置为基础参考相关文献并结合机械工程和实验动物行为学技术，对大鼠物体识别实验装置进行了改进，研制出新的封闭的物体识别实验装置。该套装置有四个实验箱和计算机系统组成，每个实验箱都是一个独立的封闭环境，这是该套装置最大的特点。封闭装置能够模拟自然环境从而避免了外部因素对实验的干扰，并且封闭装置方便实现光照条件的稳定和均一，特别利于今后自动化分析处理系统的实现。

本文从两个方面对新装置的可行性进行验证，首先用正常Wistar雄性大鼠分别在传统开口装置和新研制封闭装置中进行物体识别实验，对两种环境下大鼠的辨别能力和探索水平进行比较。在封闭装置中，正常雄性Wistar大鼠对新奇物体的探索时间明显多于对熟悉物体的探索时间，并且d2也大于0，说明正常动物能够辨别出熟悉期物体表现出正常的识别记忆能力，并且封闭组和敞口组的相对辨别指数之间没有差异，说明新研制的封闭装置和传统的敞口装置一样都能够进行大鼠物体识别实验。敞口组大鼠虽然对新奇物体和熟悉物体的探索时间有明显差异，但是d2与0比较没有差异，且测试期探索时间明显少于封闭组，两组的绝对辨别指数也明显不同，说明敞口环境下正常大鼠的探索水平受到一定程度的限制。这一结果与使用大的矿场装置能增加探索水平的报道不一致［3］，可能是外部声音、光线等因素影响了正常大鼠的探索水平，导致个别动物测试期时对物体的探索总时间少而对熟悉物体的探索时间却远大于对新奇物体的探索时间或不探索任何物体的情况出现，在数据处理时需要剔除测试期对物体没有进行探索的大鼠，降低了样本量。在封闭装置中，大鼠不同个体对物体的探索时间较均一，出现极端情况的可能性较小，使得辨别指数的可靠性增加，而且对实验条件(灯光、声音等)的可控性方面更具优势。一般选用200 g或300 g左右成年雄性Wistar大鼠进行物体识别实验研究或药效学研究［13－17］，本实验选择230±10 g和340±10 g正常雄性Wistar大鼠作为实验动物，进行物体识别实验对新装置的可行性再次进行验证。选用Wistar大鼠是基于正常情况下在间隔1 h时，该种大鼠能够表现出很好的辨别能力［18］，而选择雄性大鼠是考虑到实验室初步建立该检测方法尽量减少方法本身之外的其他因素的影响，因为有研究表明雌性大鼠进行物体识别实验的结果受其生理周期的影响［13，17］。在新研制的封闭装置中，两组大鼠都能够辨别出物体，表明对熟悉物体有记忆，并且两组之间的相对辨别指数没有明显差异，进一步说明新研制的实时监测装置能够进行物体识别实验。两组大鼠熟悉期探索时间、绝对辨别指数都明显不同，说明在此装置中物体识别实验能够敏感的检测出两种不同体重大鼠探索水平的差异。

本文主要介绍了新研制的大鼠物体识别实验装置，并从两个方面对其可行性进行了验证，在初步建立物体识别实验方法的基础上，研制了一种稳定、可靠的用于检测大鼠识别记忆的行为学实时监测装置，并为今后物体识别自动化、智能化的实现提供科学依据。

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