CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

高正琴，岳秉飞，关伟鸿

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

CAR菌(Cilia-associated respiratory bacillus)与慢性呼吸道疾病(chronic respiratory disease，CRD)的发生密切相关。细菌学检查主要靠尸检，通过银染技术做组织学检查，在呼吸上皮纤毛中检出CAR菌可确诊，但生前很少能作出诊断［1－2］。迄今为止，国内外尚未见用 TaqMan MGB(groove binder，小沟结合物)探针实时荧光定量 PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)检测CAR菌的研究报道。本研究利用新一代TaqMan MGB探针技术，建立了一种特异敏感检测CAR菌的实时荧光定量PCR方法，并成功应用于临床标本中CAR菌的快速定量检测。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和菌株来源

TaqMan mix、无核酸酶水(nuclease-free water)购自美国ABI公司。细菌基因组DNA提取试剂盒、通用型基因组DNA提取试剂盒、dNTP mixture、EX Taq、agarose、DNA ladder marker购自宝生物工程(大连)有限公司。含有 CAR菌 16S rRNA(16S ribosomal RNA，核糖体核糖核酸)基因的阳性对照品由本实验室保存，标准质粒DNA浓度为2.7×1011拷 贝/μL。 肺 炎 支 原 体 (Mycoplasma pneumoniae)、侵 肺 巴 斯 德 菌 (Pasteurella pneumotropica)、支气管鲍特杆菌(Bordetella bronchiseptica)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠埃希菌 (Escherichia coli)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的DNA由本实验室保存。

1.2 标本来源和DNA提取

2008～2012年采集动物源性标本1 344份。野生成年树鼩捕获自云南昆明野外;灰仓鼠来自新疆自治区;金黄地鼠来自四川成都;小型猪、长爪沙鼠、大鼠、小鼠分别由北京20多家动物养殖中心提供。对于树鼩、小型猪、灰仓鼠、金黄地鼠、长爪沙鼠、大鼠、小鼠活体采集全血，离心收集血清。小型猪活体采集鼻腔分泌物，安乐死后采集脑、气管、淋巴结、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、肠标本。大鼠、小鼠安乐死后采集肺脏、肝脏、肠标本。各种标本总数及收集年份见表1。用细菌基因组DNA提取试剂盒提取肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎链球菌DNA。按通用型基因组DNA提取试剂盒说明书操作提取野生树鼩、小型猪、灰仓鼠、金黄地鼠、长爪沙鼠、大鼠、小鼠标本DNA。DNA置于－70℃保存待用。

1.3 CAR菌荧光定量PCR引物和TaqMan探针设计

根据CAR菌16S rRNA基因序列(GenBank登录号:L11886.1)，经过同源性分析［3～4］，用 Primer Expression 3.0软件设计引物和探针。正向引物GZQCAR16STF:5'-GGTTCCTCGCGTATCATCGAATT AA-3';反向引物 GZQCAR16STR:5'-ACGATCGC AAGGTTGAAACTCA-3';探针 GZQCAR16STP:FAMCCACATGTTCCACCTCTT-MGB-NFQ。扩增产物片段大小为89 bp。荧光定量PCR引物和TaqMan探针由美国ABI公司合成。

1.4 CAR菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR

总反应体系为20 μL，包括正、反向引物(各900 nmol/L)和探针(250 nmol/L)共 1 μL、TaqMan mix 10 μL、模板 DNA 1 μL、nuclease-free water 8 μL。循环参数:95℃ 20 s;95℃ 3 s，60℃ 30 s，共 40个循环。用仪器自带SDS软件实时观察PCR荧光扩增曲线并采集数据。

1.5 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR标准曲线构建

分别取1 μL稀释后的标准质粒(2.7×100～2.7×1010拷贝/μL)作为模板，同上条件进行TaqMan MGB探针法荧光定量PCR反应。每个稀释度平行重复3次试验。将上述标准质粒与其Ct值进行回归分析，经对数拟合作图形成标准曲线。根据标准曲线能够推断出待测标本中CAR菌的载量。

1.6 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法的敏感性试验

将CAR菌标准质粒(2.7×1011拷贝/μL)作10倍倍比稀释，分别取1 μL稀释后的标准质粒(2.7×100～2.7×1010拷贝/μL)为模板，同上条件进行荧光定量PCR反应，检测建立的荧光定量PCR方法能检出最小标准质粒拷贝数，分析该方法灵敏性。

1.7 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR特异性试验

以CAR菌标准质粒、肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌核酸和无核酸酶水为模板，同上条件进行荧光定量PCR反应，分析该方法特异性。

1.8 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR重复性和稳定性试验

将CAR菌标准质粒、TaqMan MGB探针荧光定量PCR引物等反复冻融9次，分别取1 μL稀释后的标准质粒(2.7×100～2.7×108拷贝/μL)作为模板，同上条件进行TaqMan MGB探针法荧光定量PCR反应。在同1个试验中，每个稀释度标准质粒做3个复孔，以分析组内差异。再以相同标准质粒为模板，连续3天进行3次独立重复试验，以分析组间差异。通过统计计算Ct(在扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数(threshold cycle)相对标准差(relative standard deviation，RSD)验证该方法的重复性和稳定性。

1.9 CAR菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR和普通PCR检测实际标本

为了评价本研究建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对实际标本检测的实用性，分别以野生树鼩、小型猪、灰仓鼠、金黄地鼠、长爪沙鼠、大鼠、小鼠的标本DNA为模板，同上条件进行实时荧光定量PCR反应。

根据 CAR菌16S rRNA基因序列，用 Primer Premier 5.0软件设计一对 PCR引物，正向引物GZQCAR16SF:5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTTAGC C-3';反向引物 GZQCAR16SR:5'-AGTAGGACTCG GTCCTAGTTTGAGA-3'。预期扩增片段大小1 490 bp。PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。分别以野生树鼩、小型猪、灰仓鼠、金黄地鼠、长爪沙鼠、大鼠、小鼠标本DNA为模板，采用CAR 菌 普 通 PCR 引 物 (GZQCA16SF、GZQCA16SR)、反应体系(5 μL 10 × PCR buffer，4 μL dNTP mixture，正、反向引物各 1 μL，0.25 μL EX Taq DNA 聚 合 酶，5 μL 模 板 DNA，33.75 μL nuclease-free water)和扩增条件(94℃预变性5 min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共30 次循环;最后一次循环后72℃再延伸5 min)进行检测。反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2 结果

2.1 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR标准曲线构建

将上述标准质粒与其Ct值进行回归分析，经对数拟合作图形成标准曲线，回归方程为y=－3.22x+38.048，斜率为 －3.22，相关系数 R2为0.999，扩增效率为104.432%(图1)。

图1 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR标准曲线构建Fig．1 Construction of standard curve of the TaqMan MGB probe-based fluorescence quantitative PCR for detecting cilia-associated respiratory bacillus

2.2 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR敏感性试验

将CAR菌标准质粒(2.7×1011拷贝/μL)进行10倍连续稀释，取不同浓度的标准质粒(2.7×100～2.7 ×1010拷贝/μL)各 1 μL 作为样本，按上述TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测以分析该方法的灵敏度，实验重复3次。结果显示，本方法最低可检测2.7×100拷贝/μL的质粒DNA(图2)。

2.3 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR特异性试验

图2 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR敏感性试验Fig．2 Results of sensitivity test of the TaqMan MGB probe-based fluorescence quantitative PCR for detecting cilia-associated respiratory bacillus

对CAR菌标准质粒、肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌核酸和无核酸酶水进行 TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测，分析该方法的特异性。结果CAR菌标准质粒出现特异荧光扩增曲线;而肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌和无核酸酶水均未见特异荧光扩增曲线和Ct值升高(图3)。结果表明本方法特异性为100%。

2.4 TaqMan MGB探针荧光定量PCR重复性和稳定性试验

将不同拷贝数的CAR菌标准质粒(2.7×100～2.7×109拷贝/μL)、TaqMan MGB 探针荧光定量PCR引物等反复冻融9次，然后连续3天测定3次，同一时间重复测定3孔，计算组内和组间差异。结果显示，组内RSD为0.30% ～2.31%，组间RSD为0.25% ～4.97%，RSD值均＜5%(表1)。结果证明该方法具有良好的稳定性和重复性。

图3 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR特异性试验结果Fig．3 Results of specificity test of the TaqMan MGB probe-based quantitative PCR assay for detecting cilia-associated respiratory bacillus

表1 CAR菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR重复性试验Tab．1 Results of reproducibility test of the TaqMan MGB probe-based real-time fluorescence quantitative PCR assay for detecting cilia-associated respiratory bacillus

表2 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检测CAR菌Tab．2 Results of the TaqMan MGB probe-based fluorescence quantitative PCR for detection of cilia-associated respiratory bacillus

2.5 CAR菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR和普通PCR检测实际标本

用CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR检测1 344份标本结果可以判定为阳性的标本有510份(表2)。检出的阳性标本用CAR菌普通PCR能扩增出特异性目的片段。CAR菌阳性样本核酸序列测定和基因分型研究结果另文报道。

3 讨论

目前，国内外还未见有野生树鼩、小型猪等CAR菌感染的研究报道。GenBank中也未见有CAR菌的全基因组序列公布。本研究采用TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对1 344份临床标本进行检测，结果，从野生树鼩、小型猪、灰仓鼠、长爪沙鼠、金黄地鼠、大鼠、小鼠标本中均检出了CAR菌，其中小鼠、金黄地鼠、小型猪的CAR菌感染较为严重。

CAR菌是一种未分类的、细丝状、革兰氏阴性菌。因CAR菌会同其他呼吸道菌或病毒引发呼吸系统疾病，该菌仅在细胞培养或补充胎牛血清细胞培养基中呈滑动性和增长，故常规细菌学检查阳性率 不 高［5－10］。 间 接 免 疫 荧 光 试 验 (indirect immunofluorescence assay，IFA)等血清学方法无法对CAR菌的早期感染做出诊断［11］。普通PCR却存在着操作步骤繁琐、容易造成污染、难以准确定量检测等不足。近年来，实时荧光定量PCR技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析、突变和多态性研究、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用。与普通的TaqMan探针比较，MGB探针具有两大特点:一是探针3'端标记了自身不发光的淬灭分子，以取代常规可发光的TAMRA等荧光标记。这使荧光本底降低，荧光光谱分辨率得以大大改善。二是探针3'端增加了一个MGB。MGB可以稳定探针与模板的杂交，提高探针的退火温度，一方面缩短了探针长度，使荧光基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好;另一方面，也提高了探针的特异性，使结果更精确，分辨率更高［12］。因此，运用时效性和准确性均比较高的TaqMan MGB探针荧光定量PCR技术阶段性的开展CAR菌监测工作，阻断感染的中间环节，必将有效地预防和控制疾病的发生。

综上所述，本研究以16S rRNA为靶基因，应用TaqMan MGB探针荧光定量PCR技术，实现了对CAR菌的定量分析，并将此方法首次成功应用于临床标本中CAR菌的检测。建立的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有准确、可靠、快速检测的特点，可推广应用于动物源性产品、生物制品中CAR菌的检验、食品药品安全检验、环境监测、流行病学调查等诸多领域，为提高CAR菌的检出率提供特异有效的评价手段。

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