吉林长白县大林姬鼠中检测到Amur样病毒核酸*

姚李四 邵丽筠 王 刚 刘 阳 刘勇先 浦 昀 燕青丽张晓龙 张 吉 徐宝梁 王宝麟** 赵彤言

(1.军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100123；3.吉林出入境检验检疫局，长春 130062；4. 长白出入境检验检疫局，吉林长白 134400)

汉坦病毒是分节段的负链RNA病毒，属于布尼亚病毒科，其基因组由大(L)、中(M)和小(S)3个基因片段组成，分别编码依赖RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白Gn、Gc以及核蛋白。目前已发现至少30种不同型别的汉坦病毒，除一种外，其余的皆由鼠携带，传播给人引起肺出血热综合征和肾出血热综合征，汉坦病毒的基因型别与宿主动物之间大致存在一一对应的共进化关系(Plyusnin, 2002)。绝大多数肾出血热综合征病例发生在中国，主要是由黑线姬鼠携带汉滩病毒引起的重型出血热和由褐家鼠携带汉城病毒引起的轻型出血热。近几十年来，由于综合性防控措施的开展，中国出血热的病例和死亡率显著下降，但东北地区出血热的流行情况依然十分严重(Zhangetal., 2010)。

前期的研究显示，东北地区汉坦病毒具有复杂的病原谱，至少存在4种型别的汉坦病毒，分别是puumala病毒(Liuetal., 2003; Zhangetal., 2007)、汉滩病毒(姚来顺etal., 2009)、Amur样病毒(Zhangetal., 2007)和汉城病毒(Zhang, 2009)。长白县属于吉林省东部，位于长白山主峰南麓，从1986年报道有出血热病例以来，每年皆有病例报道，前期的研究显示该县存在汉坦病毒(刘红秋等，2001)。该县属于山林地貌，大林姬鼠是当地的优势鼠种之一，当地是否存在Amur样病毒，此前尚未有研究，从2009年9月开始，中朝跨境医学媒介联合监测项目在中方的长白县和朝方的两江道地区开展，2011年，从800 m以上次生林生境中采集的大林姬鼠样本中，检测到Amur样病毒核酸的存在，报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本采集

2011年6、9月在长白县(经度：41.27；纬度：128.14)，以油炸花生为诱饵用鼠笼捕鼠，每个地点每天布放鼠笼和鼠夹各100个，连续捕鼠3天，捕获地点高度从850～1 085 m。每天傍晚布放鼠笼鼠夹，次日清晨收回，用乙醚麻醉捕获的鼠后分拣寄生虫，随后将其在实验室内解剖，取鼠肺、置于细胞冻存管内，保存于液氮中，用干冰运送回中国检验检疫科学研究院保存于液氮中。

1.2 鼠肺的研磨

将鼠肺标本从液氮中取出，置于冰上，在2级生物安全柜内将重约25 mg 的鼠肺，置于2 mL离心管内(管内提前加入2个3 mm 不锈钢珠)， 加入1 mL RPM 1640 培养液，用组织研磨器(Tissuelyser，Qiagen，德国)研磨1 min，使组织成匀浆。将匀浆液4℃，1 000 g 离心1 min，上清转至1.5 mL 离心管，用于核酸提取。

1.3 鼠肺总RNA 的提取及cDNA的制备

从鼠肺研磨上清中提取总RNA，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen，德国)，按说明书操作。取上述总RNA 5 μL放入200 μL的Eppendorf管中，加入2 μL P14引物(10 pmol/μL)，94℃变性3 min后迅速放入冰浴中退火杂交，然后依次加入2 μL 4×dNTPs(10 mmol/L)、0.5 μL RNasin、1 μL AMV逆转录酶、4 μL AMV逆转录酶缓冲液，以DEPC高压灭菌水补足20 μL。将以上混合体系混合，42℃作用60 min，72℃10 min灭活。

1.4 PCR及电泳

1.4.1引物: Amur病毒3个片段扩增及鼠种鉴定的引物如表1。

表1 扩增所用的引物名称及序列Tab.1 Primer name and sequence in this paper

1.4.2PCR反应: 取5 μL上述合成的cDNA为模板，依次加入10 μL 10×Buffer、4 μL dNTP、3 μL MgCl2(25 mmol/L)、各组上游和下游引物各1 μL、0.5 μL Taq DNA聚合酶，以高压灭菌水补足50 μL的反应体系，稍加离心后，放入PCR扩增仪。PCR反应条件为：94℃预变性3 min；然后进入循环94℃，1 min, 52℃，1 min, 72℃，2 min，共35个循环; 最后72℃，延伸10 min。PCR扩增产物，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。克隆后送往北京华大基因公司进行序列测定。

1.5 序列分析和进化树构建

同源性序列分析采用Lasergene8.0软件中的Megalign (Clewleyetal., 1997)程序，M片段编码阅读框(3 409个核苷酸)序列用来进行进化树构建，运用Mega5.1(Tamuraetal., 2011)软件中邻位法(Neighbor-Joining method, NJ method)程序，分析采用T92+G+I模型，其中G=0.85，I=0.40，categories=5，bootstraps=1000。

2 结果

2.1 采样结果和鼠肺样本检测结果

两次共采集大林姬鼠21只，从鼠肺样本中检测到Amur病毒特异性L片段序列2份，两份样本分别来自850 m和1 085 m两个采样点，两个扩增序列有一个碱基的差异，随后对其中一个样本的M和S片段的基因组进行了扩增测定。

2.2 扩增结果

L片段扩增大小为358 bp，M片段扩增片段分别为782、918、743、765和467 bp，S片段扩增大小约为1.8 kb。用1.5%琼脂糖电泳结果如图1所示。测定后的序列提交NCBI进行登陆，L、M、S片段登录号分别为JX119008、JX119009和JX119010。

图1 Amur病毒L(左)、M(中)和S(右)PCR扩增电泳图Fig.1 The result of PCR amplified of Amur virus L segment(left),segment(middle) and S segment(right)M：DL2000；A19, A99：A19, A99株L片段扩增结果；M1～M5：M1～M5各片段扩增结果；AS:S片段全长扩增结果.M:DL2000; A19,A99: L fragment of A19 and A99 strain; M1～M5：M1 to M5 fragment; AS: S fragment.

2.3 同源性比较和进化树构建

根据和NCBI上公布的序列比对，结果显示L片段和Amur病毒俄罗斯株AP209的同源性为88%，和韩国Soochong病毒SC-1株的同源性为86.7%(表2)。S片段和NA33株最接近，序列同源性为97%，和AP209的同源性为91%，和Soochong病毒SC-1、SC-3株的同源性分别为91.9%、87.8%(表3)。与汉坦病毒原型株76-118以及吉林汉坦病毒CJAp93株的同源性皆小于85%。

表2 L片段部分序列同源性比较Tab.2 Pair distance of partial sequence of L segment

注：三角上部分为序列相似度(百分数)，三角下部分为序列变异度(百分数)。表3同。

Note:Percent identity was showed in upper triangle, divergence was showed in lower triangle.The same with Tab.3.

表3 S片段序列同源性比较Tab.3 Pair distance completed sequence of S segment

图2 基于邻位法构建的M片段进化树Fig.2 Phylogenetic tree of M segment based on Neighbor-Joining method

用M片段编码阅读框构建的系统进化树显示，M片段和H5株最为接近，序列同源性超过95%；和AP209的同源性为93%，和Soochong病毒SC-1、SC-3株的同源性分别为87.2%、86.4%。基于序列特征，俄罗斯远东Amur病毒和我国报道的Amur病毒亲缘关系较近，为同一亚型(图2)。

3 讨论

Yashina等(2000)测定了远东地区收集的110份出血热病人的M基因的256个碱基核酸，发现存在3个不同的进化群，并将其中一个命名为Amur病毒，与76-118汉坦病毒原型株的序列存在约15%到19%左右的变异。该作者又于次年报道从大林姬鼠中检测到该病毒样核酸，与从病人检测到的核酸仅存3.1%到6.6%的核酸差异，并指出Yan等于1999年提交的汉坦病毒H8205株的序列和Amur样病毒极其类似，证实中国也存在Amur病毒(Yashinaetal., 2000)。接着Lokugamage等(2002)对该类似病毒进行了M和S片段全序列测定，并发现M片段G2区的两个氨基酸的改变可区分Amur样病毒和其他汉坦病毒；并认为，由于大林姬鼠在东亚地区广泛存在，Amur样病毒及其引起的病例在东亚也应该是广泛分布(Lokugamageetal., 2002)。随后，有研究在大林姬鼠中首次分离到Soochong病毒，该病毒和Amur病毒可能由同一祖先进化分支而来(Baeketal., 2006)。我国学者进一步指出，两种病毒应为同一进化分支病毒(Jiangetal., 2007)。

实际上，在我国Amur样病毒也分布广泛，从人血清中测定的Amur样病毒有H820株、H5株， Liu株(黑龙江)、B78株(山东)等，另外，我国疫苗株A16已被证实是汉滩病毒和Amur样病毒的重组病毒(Maetal., 2012)，这也提示我国中部地区也存在Amur样病毒。2007年又在吉林大林姬鼠中检测到该病毒的存在(Zhangetal.,2007)。

长白县属于鸭绿江源头区域，森林覆盖面积占80%以上，海拔高度大于700 m，大林姬鼠是当地的优势鼠种之一。本次研究在该区域区发现Amur样病毒的存在，提示该地区的部分出血热病例可能也由此病毒引起。其遗传距离和H5株的值最小(0.25)，和JilinAP06的遗传距离值稍大(0.47)，进化图显示我国和俄罗斯的Amur样病毒具有聚集性，这对于研究Amur样病毒的进化传播具有意义。