云南省西北部分地区小兽类宿主中巴尔通体感染特征研究*

张耀允 黎 浩 龚正达 赵晓光 刘 玮**

(1. 安徽医科大学研究生学院，合肥 230032；2. 军事医学科学院微生物流行病研究所，病原微生物学生物安全国家重点实验室，北京 100071；3. 云南省地方病防治所，云南大理 675600)

巴尔通体Bartonella是一种寄生于脊椎动物红细胞内的革兰阴性杆菌(Boulouisetal.，2005)。目前，发现的巴尔通体有24种及亚种，其中至少12种可以引起人类疾病(Hennetal.，2007)，如：猫抓病(Dolanetal.1993)、战壕热(Maurinetal.1996)、心内膜炎(Drancourtetal.，1996)、杆菌性血管瘤(Koehleretal.，1992)等疾病。云南省位于中国西南部，其地形复杂，存在多种气候类型，因此小兽类宿主分布广泛。近年来，有相关文献报道了云南地区健康人群中存在巴尔通体感染(白瑛等，2004)。为进一步研究其传播途径和防治方法提供重要依据，本次研究选取云南西北部高山地区，对其中小兽类宿主感染巴尔通体的情况进行调查。

1 材料与方法

1.1 标本采集

2005与2006年10～11月间，在云南西北部怒江傈僳族自治州和迪庆藏族自治州共选取10个采样地。采样点分布于海拔1 200～4 300 m之间，包括高寒山区、高原气候、亚热带季风季候、温带季风气候以及各气候类型间的过渡区域，该区域有丰富的物种多样性。采用夹夜法捕捉野生小兽，然后无菌操作取脾脏，置于离心管中，液氮内保存。

1.2 DNA提取

脾脏DNA提取：取10 mg脾脏样本研磨后，采用TIANamp Genomic DNA Kit 组织基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，按说明书逐步提取DNA。

1.3 聚合酶链反应(PCR)

以提取的DNA为模板，采用聚合酶链反应对热休克蛋白groEL基因(Inoueetal.，2009)进行扩增以证实是否存在巴通体，所用核苷酸引物： groEL277F：5′-ACTGTTTT(A/G)GGACA(A/G)GCTATTG-3′;GroEL572R：5′-TCAACG ACTTC(C/T)AATTCCGTT-3′，扩增长度294 bp，以BartonellaquintanaRM-11(GenBank: CP003784)为阳性对照。PCR反应体系30 μL，DNA模板2 μL， 10×PCR缓冲液3 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，去离子水22.8 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min; 94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，40个循环; 72℃后延伸7min，反应在ABI 9700PCR仪上进行。

1.4 电泳

PCR反应完成后，取PCR产物5 μL加入1.5%的琼脂糖凝胶(含EB)的加样孔中，用DL2000 DNA Marker 作参照(TaKaRa，大连)，120 V电压下电泳30 min，取出胶块，置于凝胶成像仪中观察并记录结果。

为避免污染引起假阳性反应，DNA的提取，反应液的制备，模板DNA添加，PCR扩增及电泳观察均在不同的房间进行，反应液制备与模板DNA添加所用的移液器分开专用，同时每次实验都设立空白(水)对照。

1.5 统计学分析

使用SPSS 17.0软件进行统计分析。采用卡方检验或Fisher’s精确检验比较不同小兽种间、气候类型及海拔间感染率差异，P<0.05判定具有统计学差异。

2 结果

2.1 捕获动物情况

本次研究共捕获688只动物，其中以姬鼠属为优势鼠种共182只，其次为绒鼠属151只、白腹鼠属134只、鼩鼱类112只、鼠兔属39只、大足鼠29只、田鼠属25只，其他小兽(松鼠、黄鼬等)15只。

2.2 PCR检测结果

共检测出巴尔通体阳性标本72份，阳性率为10.47%。所有阳性结果经测序分析，均为巴通体的相应序列(图1)。

图1 groEL基因片段的凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis image of amplified groEL partial sequenceM：DL2000; 1：阳性对照; 2～14: 阳性样本；15：空白对照。M: DL2000; 1: Positive control; 2-14: Positive samples; 15: Blank control.

按不同鼠种类型进行比较发现，姬鼠属阳性率最高(46/182， 25.27%)，其样本次为田鼠属(2/25，8.00%)，绒鼠属(9/151，5.96%)，大足鼠(2/29，6.90%)，白腹鼠属(5/134，3.73%)，鼠兔类(1/39，2.56%)，不同小兽的检测阳性率之间有显著性差异(P<0.001)(表1)，证明在本次研究调查区域内，姬鼠属比其他小兽类宿主更易携带巴尔通体。

表1 云南省小兽类宿主动物中巴尔通体感染情况Tab.1 Prevalence of Bartonella infection in small mammals of Yunnan

卡方检验比较不同宿主间阳性率，P<0.001，χ2=64.756.

Indicates statistically significant difference,P<0.001，χ2=64.756 by Chi-square test.

本次研究选取采样点分属于不同气候类型(段旭等，2011)：小中甸千湖山、千湖山、鹿马登乡、片马镇地区属温带季风气候，该地捕获小兽的阳性率为10.51%(39/371)，各咱红山与德钦升平镇地区属高寒山区，捕获小兽的阳性率为4.94% (4/81)，虎跳峡与福贡上帕镇属亚热带季风气候，捕获小兽的阳性率为13.16% (5/38)，三坝纳西族乡与团结村地区属高原气候，阳性率为12.12% (24/298)。卡方检验发现，不同气候类型间阳性率无显著性差异，P=0.207(表2)。

本次研究采样点分布于海拔1 200～4 300 m的高原山区，根据不同海拔将样本分成4组(表3)：1 200～2 000、2 000～3 000、3 000～4 000、4 000 m以上。统计学分析发现，不同海拔间阳性率分别为9.05%，13.85%，7.89%和15.07%，卡方检验发现各组间阳性率无显著性差异，P=0.207。

2.3 序列分析

从本次研究所扩增到的巴尔通体groEL基因中选取4株有代表性的序列与GenBank中12株标准序列，选择根瘤菌(AY837546)为外群，采用MEGA5.1软件进行比对，应用Neighbor-Joining方法绘制系统发育树(图2)，选择bootstrap分析，绘制重复参数设置1 000次。进化分析表明，在云南西北部地区的小兽宿主中的巴尔通体分为两种基因型Bartonellatribocorum、Bartonellarattimassiliensis。

结果显示本次研究中的云南香格里拉小中甸千湖山地区捕获的短尾鼩(编号305)、泸水片马镇地区捕获的灰颈鼠兔(编号417)为代表的序列与B.rattimassiliensis(AY515128)同源性达97%，属于同一分支。而在福贡亚坪地区捕获的中华姬鼠(编号653)中检测的巴尔通序列与B.tribocorum(AM260525)同源性最高，达到99%。

表2 云南省不同气候类型小兽类宿主动物的巴尔通体感染率Tab.2 Infection rate of Bartonella in small mammal animals from different climate types

卡方检验比较不同气候类型间阳性率，P=0.207,χ2=3.287.

Indicates statistically no significant difference ,P=0.207,χ2=3.287 by Chi-square test.

表3 云南省不同海拔捕获小兽类宿主动物的巴尔通体感染率Tab.3 Infection rate of Bartonella in small mammal animals from different altitude

卡方检验比较不同海拔间阳性率，P=0.219,χ2=3.243.

Indicates statistically no significant difference,P=0.219,χ2=3.243 by Chi-square test.

图2 基于巴尔通体groEL基因部分测序结果的进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on partial groEL gene of Bartonella●：本研究所测得序列Sequence used in this study; Bartonella clarridgeiae：克氏巴尔通体；Bartonella rochalimae：罗氏巴尔通体；Bartonella henselae：汉赛巴尔通体；Bartonella quintana：五日热巴尔通体；Bartonella doshiae：多氏巴尔通体；Bartonella birtlesii：布氏巴尔通体；Bartonella grahamii：格氏巴尔通体；Bartonella taylorii：泰氏巴尔通体。

3 讨论

国内外研究证实巴尔通体在小兽类宿主中的带菌率很高，英国地区62.2%(23/27)(Birtlesetal.，1994)，美国南部42.7%(119/279)(Kosoyetal.，1997)，美国西北部33.3%(37/111)(Jacomoetal.，2002)。在我国云南地区，几次对啮齿类动物巴尔通体自然感染情况的调查研究中显示，其平均感染率在14.1%～44.3%(白瑛等，2002; 白瑛等，2003; 栗冬梅等，2004a；栗冬梅等，2004b)。携带巴通体的主要宿主动物为猫、犬、牛以及啮齿类，其中野生啮齿类的检出率最高。本次研究中云南西北部地区小兽类宿主的巴尔通体带菌率为10.47%，略低于其他文献报道。

以往文献中未曾报道云南地区松鼠属携带巴通体的报道，本研究共捕获8只松鼠，其中6只隐纹花松鼠Tamiopsswinhoei，2只眀纹花松鼠Tamiopsmacclelland，在怒江傈僳族自治州福贡县上帕镇捕获的隐纹花松鼠中检测到1只携带巴尔通体，为云南地区松鼠属可以在自然状态下携带巴通体提供证据。

在本次研究中所捕获的688只小兽中，各种属中都有巴尔通体检出，其中姬鼠属检出率最高(25.27%)，明显高于其他鼠种，证明在本次研究采样地区，姬鼠属比其他宿主更容易携带巴尔通体。国内研究报道，我国云南省存在巴尔通体疫源地，在疫源地内的优势鼠种分别为黄胸鼠与齐氏姬鼠，而本次调查研究捕获宿主中未见黄胸鼠，分析原因为本次采集地海拔较高，大多为高原山区，而黄胸鼠主要分布于低海拔地区。本研究采样点的选择按照不同气候类型和海拔分组，确保采集样品对不同类型生境的代表性。分析不同海拔和气候对小兽类宿主的巴尔通体带菌率，其差别无统计学意义。说明在不同海拔与气候类型中的小兽类宿主均存在对巴尔通体的携带且无选择差异。

本研究中所检出的巴尔通主要分为两种基因型Bartonellatribocorum、B.rattimassiliensis，该两种基因型的巴尔通体分布在不同的采样点，在怒江傈僳族自治州检出的巴尔通体主要为B.tribocorum型而在迪庆藏族自治州检出的巴尔通体主要为B.rattimassiliensis型，提示在不同地区的小兽类宿主中巴尔通的基因型存在差异，这可能与不同地区小兽的优势种属不同有关。

本研究首次在云南西北部高原地区检测小兽宿主的感染情况，对该地区的巴尔通体研究奠定了基础，而且该地区主要以畜牧业为主，人们在生产生活中易接触到小兽类宿主，通过对小兽类宿主的感染调查研究对该地区巴尔通的防治提供了重要依据。