CD8＋T淋巴细胞在动脉粥样硬化斑块中作用的研究

冯 静，孟晓萍

（1.北京市门头沟区医院 心内科，北京102300；2.吉林大学第二临床医学院 心内科，吉林 长春130033）

1 材料与方法

1.1 主要试剂与所需实验材料的配制

鼠抗人CD8抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。SP－9710试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。高脂饮食配制：按照重量比：10%猪油，1%胆固醇，5%蛋黄粉，0.1%脱氧胆酸，84%基础饲料。

1.2 试验动物及模型建立

实验动物购买自北京维通利华实验动物公司，共28只，8周龄，雌雄不限。其中16只为Apoe基因敲除 （Apoe－／－）小鼠，平均体重22g，随机分为高脂饮食组（以后简写为Ah）10只，正常饮食组（An）6只；另12只为与基因敲除小鼠同源的C57BL／6小鼠，平均体重17g，随机分为高脂饮食组（Ch）6只，正常饮食对照组（Cn）6只。Ah组及Ch组小鼠给予高脂饮食，An组及Cn组给予正常饮食，喂养12周。

1.3 标本制备

造模12周后，脱颈处死小鼠，快速分离主动脉（由主动脉弓至髂动脉分叉），留取主动脉弓，置于4%多聚甲醛中固定约48小时，进行脱水、透明、浸蜡、包埋等操作，获得石蜡包埋标本。

1.4 HE染色

将小鼠主动脉弓部石蜡包埋标本切片组织立即泡于10%福尔马林固定液中固定24h，予以常规石蜡包埋、切片，制成4μm切片；行HE染色。

染色结果：胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈桔红色，其他成分呈深浅不同红色，在光学显微镜下进行血管形态学观察及拍照。

1.5 免疫组织化学染色及图像分析

1.5.1 取得临床标本组织立即泡于10%福尔马林固定液中固定24h，予以常规石蜡包埋、切片；再将切片贴附于涂有多聚赖氨酸的玻片上备用，待行免疫组化染色。CD8抗体检测采用免疫组化S－P法（链霉素抗生物素蛋白一过氧化物酶），按试剂盒说明书进行。

1.5.2 图像分析 在光学显微镜下，细胞浆中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。采用单盲法阅片，每张切片随机取4个视野，应用计算机图像分析，采用Motic Images Advanced3.2图像分析仪测灰度值（灰度值越大阳性越弱）测定抗CD8免疫沉淀物灰度值对染色程度作相对定量分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠主动脉斑块活体观察结果

Ah组小鼠有动脉粥样硬化斑块形成，斑块主要集中在动脉分叉处，斑块数量中等，腹主动脉某些小鼠可见斑块。An组小鼠无动脉粥样硬化斑块形成。Ch组小鼠未见动脉斑块形成，但腹腔及各组织脏器表面脂肪含量明显增多。对照组（Cn）小鼠无动脉斑块形成。

2.2 小鼠主动脉HE染色结果

Ah组小鼠HE表现为内膜凸向于官腔形成大的斑块，内弹性膜被破坏，并可见大量泡沫细胞。Ch组小鼠HE染色可见小的斑块，内弹性膜粉染部分被破坏。An组及Cn组小鼠HE均表现为正常的血管结构，4组小鼠外膜皆为结缔组织。

图2 An组HE染色

图3 Ch组HE染色

图4 Cn组HE染色

图1－4均为镜下100倍成像：①Ah组小鼠HE表现为内膜凸向于官腔形成大的斑块，内弹性膜被破坏，内膜可见大量泡沫细胞，中膜被破坏有大量的胆固醇结晶。②An组小鼠HE表现为正常的血管结构，内膜光滑内皮细胞胞核略凸向于官腔，内弹性膜粉染清晰可见；中膜由几层平滑肌细胞组成。③Ch组小鼠HE表现为内膜略凸向于官腔，可见小的斑块，内弹性膜粉染部分被破坏；中膜由几层平滑肌细胞组成，斑块处平滑肌细胞排列紊乱。④Cn组小鼠HE表现为正常的血管结构，内膜光滑内皮细胞胞核略凸向于官腔，内弹性膜粉染清晰可见；中膜由几层平滑肌细胞组成，平滑肌细胞核为长杆状。

2.3 抗CD8免疫组化染色结果

Ah组小鼠表达很少量的黄褐色颗粒，该颗粒表示为被辣根过氧化酶标记的CD8；An组可见较多的黄褐色颗粒；Ch组，表达少量的黄褐色颗粒；Cn组黄褐色颗粒表达较多，呈强阳性；见图5～8（均为镜下200倍成像）。

图5 Ah组抗CD8免疫组化染色

图6 An组抗CD8免疫组化染色

图7 Ch组抗CD8免疫组化染色

图8 Cn组抗CD8免疫组化染色

2.4 抗CD8灰度值比较

An组，Ch，组Ah组各自抗CD8灰度值较Cn组均升高，且P＜0.01；组间CD8灰度值比Ah＞Ch＞An＞Cn，即表达CD8水平为Ah＜Ch＜An＜Cn，见表1。

表1 CD8免疫沉淀物灰度值分析（±s）

表1 CD8免疫沉淀物灰度值分析（±s）

与对照组（Cn）比较＊＊P＜0.01，有统计学意义.

组别 n CD8 P值0.01 Cn 6 71.3±1.212 An 6 103.83±5.193＊＊ ＜0.01 Ch 6 125.0±2.608＊＊ ＜0.01 Ah 10 134.7±2.497＊＊ ＜

3 讨论

近年来，免疫机制在动脉粥样硬化（atherosclerotic，AS）形成中的作用备受观注，多种细胞及细胞因子相互作用、影响，共同形成AS的免疫机制，促成了AS的发生和发展。有研究表明[1，2]，在AS斑块的进展过程中，T淋巴细胞在AS斑块内占所有有核细胞总数的10%－20%，然而T淋巴细胞在AS中究竟扮演何种角色，目前尚无定论。关于CD8＋T淋巴细胞在AS中的作用及其在AS中的表达水平亦有争论，Hsue等发现[3]耗竭C57BL／6小鼠体内CD4＋和CD8＋T淋巴细胞可以减少脂纹的形成；国内学者研究发现在CHD患者中，CD4＋T淋巴及CD8＋T淋巴两个亚群细胞的比例都有减少，其中以CD8细胞减低更为显著，T淋巴细胞功能出现异常[4]。

本实验结果显示：在AS过程中，CD8＋T淋巴细胞数量减少。我们认为无论是CD8＋T淋巴细胞减少还是增多都说明在AS过程中伴随着免疫反应。这种反应可能加重动脉粥样硬化，尤其是在ApoE基因敲除小鼠，因为高脂喂养可使ApoE基因敲除小鼠迅速形成广泛且典型的AS斑块，随时间进展，斑块体积逐渐增加，钙化逐渐加重。我们认为：CD8＋T淋巴细胞可能引起与AS相关的普遍的细胞凋亡[5]和细胞裂解机制，进而促成AS形成。而到目前为止，结合相关文献报道，其可能的机制是[6－8]：①CD8＋T细胞特异性识别靶细胞表面的抗原肽途径：MHC分子复合物后，通过颗粒胞吐释放穿孔素，使靶细胞膜出现大量小孔，因膜内外渗透压不同，水分则进入胞浆，靶细胞胀裂而死导致细胞裂解，细胞调亡。②粒酶途径。CD8＋T细胞上的T细胞受体与靶细胞表面呈递的抗原互相作用，形成聚合体。细胞中的高尔基体开始堆积，含有粒酶（granzymes）的颗粒重新定位于与靶细胞相接触的区域，并通过胞吐作用（exocytosis）释放穿孔素（perforin）和粒酶，后者在前者的帮助下进入靶细胞，激活细胞的凋亡（apoptosis）路径，诱导细胞的死亡。③Fas途径，某些CD8＋T细胞缺乏穿孔素和粒酶，它们通过Fas途径来介导细胞毒性，导致细胞的凋亡。另外，CD8＋T细胞活化后能够分泌出大量的炎症因子，包括细胞因子、趋化因子等，如白细胞介素、IFN－r、TNF－a、TNF－β等，这些因子可激活巨噬细胞，巨噬细胞再释放出多种细胞因子，起到免疫级联扩大的效应，使动脉成纤维细胞的表型发生转变，促进动脉粥样硬化的进程。细胞凋亡也可能由巨噬细胞和平滑肌在致炎细胞因子的作用下产生的活性氧和含氮类活性成分引起。

我们的实验是应用ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型，而在ApoE基因敲除小鼠的高脂饮食组动脉粥样硬化的斑块部位CD8＋T淋巴细胞表达减少，说明在疾病发生发展过程中除了细胞免疫的参与，还可出能出现错综复杂的相互协同、相互影响的抗原抗体反应，促进AS的发生、发展。目前认为可能与AS发病相关的抗原有氧化的低密度脂蛋白（OX－LDL），OX－LDL在 AS的发生发展中起多方面的作用，其一是作为抗原引发AS的免疫反应[9]。AS斑块部位的CD8＋T细胞可对OX－LDL产生免疫反应。

近年来的研究发现细胞因子、机械损伤、炎性反应、ox－LDL、氧自由基、T淋巴细胞均能调节基质金属蛋白酶（MMPs）的产生[10]。活化的CD8＋T淋巴细胞可分泌出大量的TNF－a，后者表达的升高，可导致巨噬细胞分泌的胶原酶增多及MMPs量的改变[11]，参与 AS的形成。

目前许多免疫性疾病通过免疫抑制治疗都取得了较好的疗效，把免疫机制作为AS研究的切入点，进一步研究T淋巴细胞在AS中作用机制，可以为AS的诊断和治疗提供新的方向。

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