Wortmannin对糖尿病肾病大鼠肾组织TNF－α与VEGF表达的影响

关莹莹，曹东华

（中国人民解放军第二○二医院 检验科，辽宁 沈阳110003）

磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K）／丝氨酸一苏氨酸激酶 （v－akt murine thymoma viral oncogene homolog，Akt）通路是真核细胞关键的信号转导通路，在细胞凋亡、代谢、增殖及分化等生命活动中发挥着重要功能，近年来发现PI3K／Akt信号通路与糖尿病肾病（DN）的发生发展关系密切。研究发现，糖尿病肾病大鼠模型的肾皮质中PI3K及Akt活性升高[1]，大鼠糖尿病发病4周后整个肾脏的磷酸化PKB／Akt水平增加，并且体内由Gas6肾脏因子介导的肾小球肥大与PI3K／Akt信号通路有关[2]，雷帕霉素可以缓解大鼠的DN，也能减低肾小球内活化的mTOR及Akt的升高[3]。但是PI3K／Akt信号通路在DN发病机制中具体是如何发挥作用的尚不清楚。本研究利用Western blot方法和RT－PCR方法，检测DN大鼠在注射PI3K抑制剂Wortmannin后肾组织TNF－α与VEGF表达的变化，为进一步阐明PI3K／Akt信号通路在DN发病中的作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

羊抗大鼠TNF－α与VEGF多克隆抗体（Santa－Cruz）；PI3K阻断剂（Wortmannin）购自Santa Cruz公司，STZ购自美国Sigma公司。

1.2 动物模型的建立及分组

成年健康清洁级SD大鼠40只，雄性，体重200－225g，由中国医科大学实验动物部提供。其中30只大鼠用于复制DN模型，10只大鼠作为假手术组。参照Anderson等[4]的方法复制DN模型，10%水合氯醛麻醉（0.3ml／100g），常规备皮消毒，腹部切口，暴露右肾，切除，滴加庆大霉素预防感染。假手术组仅暴露右侧肾脏，并不进行切除手术。2W后，腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），50 mg／kg，假手术组大鼠腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液。实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。48h后尾尖取血，测定血糖，血糖≥16.7mmol／L为造模成功。选取20只模型成功的大鼠，随机分为模型组与Wortmannin处理组。糖尿病模型建立次日起，Wortmannin处理组静脉注射 Wortmannin（0.5mg／kg），1次／周，共8W，实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛索及其他降糖药物，模型组与假手术组注射等量生理盐水。

1.3 Western blot方法检测肾组织TNF－α与VEGF的表达

第8周最后1次给药后，禁食8h，麻醉处死，冰上取左肾皮质，超声粉碎，离心取上清，Bradford法测定蛋白浓度，加入样品缓冲液，沸水浴中加热5 min使蛋白质变性，12%分离胶，4%浓缩胶，电泳，转印，4℃过夜。一抗 TNF－α、VEGF 与β－actin （1∶200）室温孵育2h，洗膜，IgG－HRP（1∶5000）室温孵育2h，ECL发光，凝胶成像分析系统上摄像分析，测目标带的平均光密度（MOD）。

1.4 RT－PCR法检测肾组织TNF－α mRNA 与VEGFmRNA的表达

麻醉处死大鼠，冰上取左肾皮质，标本量80－100mg，按RNAout说明书进行总mRNA提取，然后以逆转录（RT法）先合成cDNA，再进行PCR扩增；TNF－α：上 游 为 5′－CGAGTGACAAGCCCGTAGCC－3′； 下 游 为 5′－GGATGAACACGCCAGTCGCC－3′，扩增产物全长255bp。VEGF：上游为5′－ACTGGACCCTGGCTTTACTGC－3′；下游为5′－TTGGTGAGGTTTGATCCGCATG－3′，扩增产物全长310bp；β－－actin：上游为5′－GAGACCTTCAACACCCAGCC－3′；下游为：5′－GCGGGGCATCGGAACCGCTCA－3′，扩增产物全长374bp。扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，UVP凝胶显像仪扫描并进行图像分析。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 Western blot结果

Western blot结果显示，模型组与Wortmannin处理组肾组织TNF－α与VEGF蛋白的表达量均显著高于假手术组（P＜0.05），而与模型组相比，Wortmannin处理组肾组织TNF－α与VEGF蛋白的表达量明显降低（P＜0.05）。见图1，图2。

图1 Western blot方法检测各组小鼠TNF－α和VEGF蛋白的表达

图2 各组小鼠TNF－α和VEGF蛋白的光密度值比较

2.2 RT－PCR 结果

RT－PCR结果显示，与假手术组比较，模型组与Wortmannin处理组肾组织TNF－αmRNA与VEGFmRNA的表达量均显著升高（P＜0.05），而 Wortmannin处理组肾组织TNF－αmRNA与VEGFmRNA的表达则明显低于模型组（P＜0.05）。见图3，图4。

图3 RT－PCR方法检测各组小鼠TNF－αmRNA和VEGFmRNA的表达

图4 各组小鼠TNF－αmRNA和VEGFmRNA的光密度值比较

3 讨论

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）代谢异常引起的‘肾小球硬化症”，是DM常见的严重慢性微血管并发症，最终发展为肾衰竭。DN引发的终末期肾功能衰竭（ESRD）正在成为威胁糖尿病患者生命的主要原因。现代医学在控制血糖、血压等基础治疗方面取得了很大的进展，但在肾病治疗方面尚无特殊进展。DN的基本病理特征早期表现为肾小球高滤过、肾小球肥大，晚期表现为肾小球系膜区细胞外基质（ECM）增生、肾小管间质纤维化，最终导致肾小球硬化、肾功能衰竭。PI3K／Akt信号转导通路在细胞凋亡、代谢、增殖及分化等生命活动中发挥着重要功能，研究发现，灯盏花素可增加糖尿病大鼠肾脏AktmRNA的表达，进而增加抗凋亡基因bcl－2的表达，影响NF－κB的表达，抑制糖尿病大鼠肾脏肥大，发挥保护肾功能[5]，二黄糖肾康也通过激活PI3K／Akt信号通路有效降低肾脏细胞凋亡[6]，但是PI3K／Akt信号通路在DN发病机制中具体是如何发挥作用的尚不清楚。

肿瘤坏死因子－α（TNF－α）是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，一般情况下适量TNF－α可参与机体免疫反应，具有抗感染、抗病毒和抗肿瘤等作用[7]。TNF－α也可通过多种机制作用于中枢神经系统，调节神经－内分泌功能、介质释放、抗原递呈等过程[8]，TNF－α刺激肾小球系膜细胞产生氧自由基，从而使过氧化脂质代谢产物增多，造成细胞内膜损伤，同时能刺激胶原的产生和成纤维细胞的增殖，加上糖基化胶原在血管壁的沉积，促使血管结构改变，最终导致DN等微血管病变[9]，雷帕霉素抑制糖尿病肾病大鼠的肾细胞凋亡可能是通过下调TNF－α、NF－κB的表达来实现的[10]。但是在 DN 发病机制中，PI3K／Akt信号通路能够通过调节TNF－α表达参与DN的调控尚未见文献报道。本研究结果发现，DN大鼠经静脉注射Wortmannin处理后，肾组织内TNF－α蛋白和mRNA的表达均显著降低，结果提示 Wortmannin抑制PI3K／Akt信号通路后，TNF－α的表达也受到了抑制，说明在DN发病机制中，调节TNF－α的表达可能是PI3K／Akt信号通路参与DN调控的机制之一。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是体内一种强效促血管生成因子，能直接作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞的增殖，直接或间接参与血管生成，增强血管通透性，缺血或缺氧是诱导VEGF上调的重要因素[11]，它主要通过与其酪氨酸激酶受体 VEGFR－l和VEGFR－2结合发挥作用，在炎症、创伤愈合、心脏缺血、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病变等诸多与血管生成和组织愈合及再生、肿瘤形成等病理过程中发挥重要作用。研究发现，VEGF可促进糖尿病小鼠肾小球新生血管生成，其表达上调与糖尿病肾脏病变密切相关[12－14]。但是在 DN 发病机制中，PI3K／Akt信号通路能够通过调节VEGF表达参与DN的调控尚未见文献报道。本研究结果发现，DN大鼠经静脉注射 Wortmannin处理后，肾组织内VEGF蛋白和mRNA的表达均显著降低，结果提示上调VEGF的表达可能是PI3K／Akt信号通路参与DN调控的机制之一。

本实验结果的发现有利于PI3K／Akt信号通路参与DN调控的机制，能够为DN的药物治疗提供一定参考依据。

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