利用自体富血小板血浆构建凝胶生物细胞支架的实验研究

刘 伟，陈 剑，宋 佳，宋滇文＊

（1.解放军第113医院 骨科，浙江 宁波315040；2.浙江大学医学院附属邵逸夫医院 骨科，杭州310016；

3.第二军医大学附属长征医院 骨科，上海200003）

富血小板血浆（Platelet－rich plasma，PRP）是从自体血中提取出来的血小板浓缩物，来源于自体，无免疫排斥反应，制作方便，对机体创伤小。大量临床研究报道，PRP能促进骨和软组织的修复，近年来，PRP已经被应用于骨科，颌面外科，神经外科等多种学科。富血小板血浆凝胶（Platelet－rich plasma gel，PRG）是PRP被凝血酶等激活物激活后形成的胶冻状物，含有大量的各种血小板源性细胞生长因子，具有促进多种组织修复的作用，PRG作为一种新的骨修复材料，其应用范围日益扩大。PRG本身还呈现典型的多孔性结构[1]，并具有良好的粘附性，符合骨组织工程支架材料的要求，本实验即研究PRG生物细胞支架的三维空间结构以及与兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）共培养后的组织相容性，以为下一步构建组织工程骨奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 富血小板血浆激活剂的配制，取5 g 10%氯化钙（Amersco）溶于50ml去离子水，0.2 μm滤膜过滤后分装，－20℃保存。临用时在0.5 ml 10%氯化钙溶液中加入凝血酶500U（如吉生物）。

1.2 Lendersberg法制备PRP 取成年新西兰大白兔，从其耳缘静脉抽取静脉血10ml，加入2ml 0.109M柠檬酸钠抗凝；将抽取静脉血200g离心10min；吸取全部上清液直至交界面下3mm，并将其移至另一离心管；平衡后200g离心10min；离心管中液体分为2层，吸取3／4上清液弃掉，剩余即为PRP，再取20μL PRP进行血小板计数；同时取20 μl全血作为对照。此步重复三次。

1.3 血小板计数方法 于清洁试管中加入稀释液0.38ml。准确吸取待测标本20μl，擦去管尖外附着血液，置于血小板稀释液内，立即充分混匀。待完全溶血后再次混匀1min。取上述均匀的血小板悬液1滴，注入计数池内，静置10－15min，使血小板下沉。按以下公式计算：血小板数／L＝5个中方格内血小板数×5×10×20×106／L。

1.4 PRG生物细胞支架的构建 用2ml注射器依次吸入0.8ml PRP、0.2ml激活剂及少许空气，摇匀，静置5－10min，即制成PRG生物支架，并进行大体标本和扫描电镜（日立S－520）观察。

1.5 兔BMSCs在PRG生物细胞支架中的生长将通过全骨髓贴壁法培养获得的第3代兔BMSCs以0.05%胰酶／0.02%EDTA消化后，调整细胞浓度为106左右，制成兔BMSCs细胞悬液；将前步制备的PRP和BMSCs细胞悬液以4∶1的比例混合；将PRP和BMSCs混合物500μl移入15ml离心管，混合均匀后加入80μl激活剂；待PRP形成凝胶后，加入2%FBS的DMEM－LG培养基2ml左右，隔日换液，培养1周后停止培养，并将部分标本取出后剪碎，以胰酶消化后再置于10%FBS的DMEMLG培养基中继续培养，观察其形态以及增殖能力。同时将培养至第3天的部分标本固定后行扫描电镜观察。

2 结果

2.1 PRP的制备 通过Lendersberg两步离心法顺利制得富血小板血浆（PRP），方法简便快速，容易制备。

2.2 血小板计数 全血中血小板浓度三次测定结果分别为340×109／L、378×109／L和336×109／L（平均351×109／L），PRP中血小板浓度三次测定结果分别为1290×109／L、1321×109／L和1330×109／L（平均1314×109／L），与全血相比，PRP中的血小板浓度增加了3.74倍。

2.3 PRG生物支架大体标本和扫描电镜结构PRP经过激活剂激活后5－10min就形成胶冻状的PRG。扫描电镜扫描结果显示其凝胶三维结构中，主要框架结构为纤维素，纤维素之间纵横交错并形成复杂的立体网状结构，孔隙直径约50－100微米，其中附着有大量的血小板细胞和少量的红细胞（图1）。

图1 扫描电镜下PRG的三维结构图。孔隙直径约50－100微米，附着有大量的血小板和少量红细胞。

2.4 兔BMSCs在PRG中的生长 兔BMSCs在PRG中培养3天，行扫描电镜观察，结果显示：在PRG三维结构中，兔BMSCs在纤维素支架构成的纤维网络中附着良好（图2）。培养1周后将兔BMSCs和PRG构成的复合物消化后再于10%FBS的DMEM－LG中培养，1d后见培养皿底可见有梭形以及多角形细胞贴壁，1周后细胞生长良好并继续增殖（图3），证明兔BMSCs可以在PRG中存活和生长。

图2 兔BMSCs附着于PRG三维网状结构中。

图3 兔BMSCs和PRG共培养1周并消化后再培养：A，1d后见培养皿底可见有梭形以及多角形细胞贴壁；B，1周后细胞生长良好并继续增殖。

3 讨论

PRP的制作方法主要有血浆分离法、一次离心和两次离心技术。血浆分离法需要专业的血浆分离机，费用昂贵，过程复杂，难以普及。一次离心法制备PRP对血液只经过一次离心，血小板回收率低，难以得到高浓度PRP，激活后亦不能分泌足量细胞生长因子。两次离心法是目前获取PRP的主要途径，即对抽取的血液经过两次离心，有较高的血小板回收率，可获取高浓度PRP。

大多数研究证实了PRP具有促进骨修复的作用[2，3]，因此PRP目前被越来越多的应用到骨修复和骨组织工程中。PRP促进骨缺损修复可能主要基于以下两种机制：一种为PRP在激活剂作用下活化为PRG，其中含有大量纤维蛋白原，能封闭创面，促进组织收缩和愈合；另一种为聚合过程中血小板收缩、脱颗粒释放多种高浓度生长因子，包括PDGF、TGFβ、VEGF、IGF和 EGF等，这些生长因子在骨与软组织的修复过程中发挥重要作用，可以加速细胞分化[4]，促进成骨细胞和成纤维细胞的增殖[5]。这些细胞因子中中最重要的是为PDGF和TGFβ，PDGF可以促进成骨细胞生长和微血管形成，同时还能增强巨噬细胞的活性[6]，TGF－β则可促进前成骨细胞增殖并抑制骨吸收[7，8]，PRG中其他生长因子也同时具有良好的促进骨与软骨修复和再生的作用[9]。Yamada等[10]研究认为PRP和间充质干细胞混合物注射到骨缺损部位后，其骨修复作用与自体松质骨颗粒移植效果相当。当然，PRP需来源于自体，并具有一定的浓度才能达到预期效果，若采用异体血制备得到的PRP，则会因为免疫反应而得到阴性结果[11]。同时，已有大量研究结果证实PRP应用于骨组织工程时，其释放的多种生长因子亦具有明确的促进BMSCs增殖的作用[12]，因此其应用于组织工程具有其他支架材料无法具备的独特优点。

PRG在组织工程中的应用不仅作为细胞生长和分化的诱导因子，其具有特殊的三维空隙结构，孔隙直径从10μm[1]至200－1000μm[13]不等，孔隙率约80%左右，符合骨组织工程支架材料的要求。目前以PRG作为细胞支架的组织工程研究还十分有限，Del Bue等[14]将其作为支架材料用在马肌腱的组织工程重建，结果显示87.5%取得了良好效果。Drengk等[15]研究显示PRG作为细胞支架能明显促进软骨细胞与间充质干细胞的增生和向软骨细胞分化。本实验制备的自体PRG生物细胞支架孔隙直径约50－100微米，具有完整的三维结构和良好的组织相容性，与兔BMSCs复合培养后种子细胞与纤维素附着良好，血小板颗粒分布均匀，经体外培养后消化再培养仍有大量细胞生长，说明PRP与种子细胞有良好的生物相容性，与其他细胞支架相比具有诸多优点：（1）PRG生物支架材料有良好的孔隙率，本身具有丰富的细胞生长因子如 TGF－β、PDGF、IGF等，能明显促进种子细胞的增殖和转化，这是其它支架材料所没有的；（2）富PRP和自体BMSCs均来源于自体，无免疫源性；（3）与其他支架材料相比，PRG生物细胞支架材料不需要将支架与细胞在体外培养，构建组织工程骨时已与干细胞充分混匀，避免了细胞只附着于支架材料表面或长入支架材料不充分的缺点；（4）对组织损伤小，费用低，易于应用和推广；（5）将种子细胞复合PRG生物细胞支架构建的组织工程材料可经皮体外注入，操作方便。本实验结果表明自体富血小板血浆凝胶是一种优良的组织工程细胞支架，具有良好的应用前景。

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