钼酸铵分光光度法测定磷浓度实验方法的改进

2013-11-23申禹，李玲

实验技术与管理 2013年1期

申禹，李玲

（清华大学水沙科学与水利水电工程国家重点实验室，北京 100084）

磷是水环境中营养元素之一，是水体浮游藻类生长的限制性营养元素，水中磷的含量与水体发生富营养化现象密切相关。磷在水体中的含量是生产、科研中经常遇到的问题。目前磷浓度测定的方法很多，按照测定原理，可分为阴离子交换树脂法（离子色谱法）和化学方法（分光光度法）等［1］；按照化学反应过程的不同，可分为钼酸铵分光光度法、孔雀绿－磷钼杂多酸法以及罗丹明荧光分光光度法等。钼酸铵分光光度法［2］，简单易行、快速准确，得到了广泛的应用。随着这种测定方法的不断推广，在应用中出现了一些问题，比如工作波长的选择、显色反应时间的选取、样品pH值范围的确定等。目前有许多学者对钼酸铵分光光度法测定磷浓度的实验方法进行了修正。梁运江等［3］应用756CRT型紫外可见分光光度计进行600～850nm范围内的波长扫描，在690nm处出现局部吸收峰值，而最大吸收峰在722.2nm附近，830nm以上吸光度出现锯齿形波动，由于某些原因给出的工作波长未得到广泛认可。黄城等［4］认为钼锑抗法显色时间长，不稳定，磷含量少时显色不明显，且受pH值影响比较大，结合海藻中磷的测定，提出苯二酚、Na2SO3还原法。吴海燕［5］认为钼锑抗法存在过量的钼酸铵和还原剂，造成假阳性显色而干扰测定，利用硝酸铋与磷钼酸铵形成离子缔合物显色体系进行了改良。此外，对于色度浊度补偿［6］、连续流动分析［7］、水样冰冻时间的影响［8］等已有较成熟的研究。另外有很多学者对于水样采集、标准磷系列消解、温度、pH值、显色反应时间等问题进行探讨［9－15］，积累了大量实验经验。以上研究虽然在某些方面取得了一定的进展，但所做的研究工作缺乏系统性和完整性。本研究将针对钼锑抗法测定磷浓度的实验中显色反应时间、样品pH值范围、最佳工作波长等问题逐一进行探讨，并给出应用这种方法测定磷浓度实验方法的改进建议。

1 钼酸铵分光光度法的测量原理

钼酸铵分光光度法的化学机理是正磷酸盐与钼酸铵反应生成能稳定显色的磷钼蓝，光学机理为朗伯－比尔定律。在酸性介质中，正磷酸盐与钼酸铵反应，生成黄色的磷钼杂多酸（磷钼黄），反应式为

室温下，在酒石酸锑钾（锑离子）或硝酸铋（铋离子）的催化作用下，磷钼杂多酸立即被抗坏血酸或氯化亚锡还原，转化成稳定的蓝色络合物——磷钼蓝（H3PO4·10MoO3·Mo2O5或 H3PO4·8MoO3·2Mo2O5），这一反应称为显色反应。

磷钼蓝呈现蓝色，会选择性吸收与蓝色光互补的红色光（波长约为700nm）。磷钼蓝的蓝色深度与磷的含量在一定质量浓度范围内（大约0.8mg／L）服从朗伯－比尔定律，即溶液对单色光的吸收与溶液浓度及单色光通过的液层厚度成正比。光的吸收程度用吸光度表示，其定义式为

其中Iin为入射光强度，Iout为透射光强度为透光度，可表示为百分比形式。

朗伯－比尔定律用公式表示为

式中，a为吸光系数（L／（g·cm））；b为液层厚度（cm）；c为溶液质量浓度（g／L）。

若c以mol／L为单位，b以cm为单位，则写为

ε称为摩尔吸光系数（L／（mol·cm）），表示吸光物质的浓度为1mol／L、液层厚度为1cm时溶液对某单色光的吸收能力，是衡量分光光度分析灵敏度的重要标志。一般认为当ε＞104L／（mol·cm）时比较灵敏，ε＜103L／（mol·cm）时不灵敏。

摩尔吸光系数与波长有关，一定浓度的溶液在不同波长下，测得吸光度最大时对应的波长为最大吸收波长，对应的摩尔吸光系数也最大，波长微小波动对吸光度的影响也最小，测定溶液浓度的精确度和灵敏度最高。

2 测量方法分析

根据钼酸铵分光光度法的原理，磷浓度测定的准确性依赖于朗伯－比尔定律的适用性和磷钼蓝的显色效果。影响朗伯－比尔定律适用性的因素包括单色光的纯度、工作波长、样品浓度等；影响磷钼蓝显色反应的因素包括样品pH值、环境温度、显色反应时间、干扰离子的存在及色度、浊度等。单色光的纯度属于仪器精度的问题，干扰离子、色度和浊度与样品本身有关，环境温度一般选择室温，而显色反应时间的控制、工作波长的选择、显色反应时的pH值等则与实验操作有关。因此磷浓度测定中应弄清以下问题：样品消解的必要性，合适的显色时间跨度，最佳工作波长，合适的样品pH值范围。

首先，消解的目的是把总磷转化为正磷酸盐，理论上用正磷酸盐配制的标准溶液及样品溶液不需要消解，因为样品的消解过程比较耗时，如果在研究中能省略消解过程将会提高磷浓度测定效率，但省略消解过程需要实验验证。

其次，测定吸光度应在蓝色络合物磷钼蓝稳定显色时测定，同时测定多份样品（如绘制工作曲线）时很有必要确定稳定显色的时间跨度，显色稳定前可能显色不充分，超过稳定显色时间后显色可能褪去。显色反应与温度有关，因此不同环境温度下应确定相应的显色时间跨度。

再次，工作波长为最大吸收波长时，同一浓度的样品吸光度最大，分光度测定的分辨率高，而且在吸光度随波长连续平滑变化的曲线上，吸光度出现峰值时斜率为0，曲线最平坦，此时由于单色光不纯等原因导致波长微小扰动，对吸光度的影响最小。不同型号的分光光度计显示的最大吸收波长可能不同，因此有必要通过实验确定最佳工作波长。

最后，显色反应一般是在酸性环境下进行，对于不经消解而直接进行显色反应的样品，样品初始pH值可能对显色反应造成影响，目前没有这方面的资料，本文通过实验来确定不消解的样品合适的pH值范围。

3 实验方法的改进

（1）选择合适的显色反应时间跨度。参照国家标准水质总磷的测定（GB l1893—1989，以下简称标准方法），取5mL磷标准溶液（50mg／L）稀释到250mL定容，得到1.0mg／L的磷溶液。分别取1.0mg／L的磷溶液25mL于14支50mL比色管中，加蒸馏水稀释至50mL，先后滴加1mL抗坏血酸溶液和2mL钼酸盐溶液，静置3、5、10、15、20、25、30min，各取2支比色管中的磷溶液分别在700nm波长下测定吸光度。根据吸光度A的变化确定显色反应时间t跨度，结果如图1所示。

图1 吸光度随显色反应时间的变化

本实验在室温20℃下进行，图1表明显色反应时间在5～25min内，吸光度无显著性变化，因此确定此温度下合适的显色反应时间跨度为5～25min，在此显色反应时间跨度内，溶液能稳定显色，吸光度测定应在此时间跨度内完成。显色反应也是一种化学反应，反应时间与温度有关，实际操作时应根据环境温度按此方法确定合适的显色反应时间。

（2）确定最佳工作波长。取1.0mg／L的溶液25 mL于2支50mL比色管中，加水至50mL，并加抗坏血酸和钼酸盐进行显色反应，在合适的显色时间跨度内，分别设定波长为680、690、700、705、710、715、720、730nm，测定并比较吸光度，结果如图2所示。图2表明，当波长为710nm时，吸光度达到峰值，峰值很平缓，在705～715nm范围内吸光度基本无变化，且波长的微小波动对浓度测定基本无影响，由此确定实验最佳波长为710nm。

（3）分析消解对正磷酸盐浓度测定的影响。取已知浓度正磷酸盐溶液，分别经过消解和不经过消解后测定磷浓度，结果如图3所示。

图3表明，正磷酸盐溶液经消解与不经消解，测得吸光度无显著性变化。不经消解测定磷浓度主要用于实验研究，由于消解过程需要加热30min，而且要待溶液冷却，比较耗费时间，对于像吸附磷一类的实验研究中大量样品高密度的测定极不方便。通过实验确定不消解对测定结果无影响后，可减少部分实验工作量。

图2 吸光度随波长的变化

图3 消解对正磷酸盐浓度测定的影响

（4）预估合适的样品pH值范围。取5支比色管分别加入约40mL水，用HCl和NaOH调节溶液pH值分别为3、5、7、9、11；另取15支50mL比色管分成5组，每组3支，其中1支作为空白对照，另外2支形成重复对照，用移液管分别加入0.5mL磷浓度为50 mg／L的磷标准贮备溶液，每组空白对照分别加蒸馏水至50mL，重复对照则各加入大约30mL水，用HCl和 NaOH 调节溶液pH 值分别为3、5、7、9、11，调节好后总体积小于50mL，滴加pH值对应相等的水至50mL。此时获得pH 值分别为3、5、6、7、8、9、11，磷质量浓度均为0.5mg／L的系列溶液，加抗坏血酸和钼酸盐进行显色反应，测定吸光度。实验测得吸光度随样品pH值的变化如图4所示。

图4 样品pH值对显色反应的影响

图4表明，pH值在3～11范围内，同一质量浓度、不同pH值的磷酸盐溶液，用钼酸铵分光光度法测得的吸光度值相差不大，故实验中可不考虑pH值对显色反应的影响。事实上，由于抗坏血酸和钼酸盐溶液均为强酸，经实验测定，即使样品溶液pH值为12，显色反应后pH值也小于2，足以满足显色反应酸性环境的要求。

（5）确定工作曲线及合适的磷质量浓度范围。配制磷质量浓度为0.0、0.02、0.04、0.12、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg／L的标准系列正磷酸盐溶液，在最佳工作波长下和合适的时间跨度内测定吸光度，实验数据见图5。并利用已知浓度溶液进行回收率实验。

图5 工作曲线及线性范围

图5表明，根据样品质量浓度小于0.8mg／L的实验数据可拟合出线性回归方程为c＝2.026A，R2＝1.000，P＜0.001，并且回收率在98%～103%之间。若可读取的最小吸光度为0.001，则最低检测限约为0.002mg／L。同时磷质量浓度为1.0mg／L时，测定结果开始偏离拟合的直线，说明吸光度随磷质量浓度线性变化的磷质量浓度范围为0～0.8mg／L。因此考虑到测定结果的精度，测定时应预估样品磷质量浓度，并稀释至0.1～0.8mg／L范围内进行测定，这样钼酸铵分光光度法就可测定任意质量浓度的磷。