血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞衰老及对炎症因子分泌的影响

邹美圣 刘凌 刘泽 王鲁妮 吴军 王伟 封菊香

人类进入老年期后，随增龄与衰老相关的各种疾病如动脉粥样硬化(AS)的发生率也随之上升，而内皮细胞生物学改变是人类衰老和疾病的基础，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在其中起着重要的作用[1]。AngⅡ是RAS系统中最具活性的成分，具有促炎症活性和氧化活性，参与慢性炎症过程。AngⅡ由AT1介导可通过多种机制产生对内皮细胞的致炎作用[2]。炎性衰老的概念由Franceschi等[3]在2000年首次提出，炎性衰老中的促炎性反应与老年相关疾病如AS等密切相关[4]。目前炎性衰老的机制主要有应激论和细胞因子论[5]，细胞因子论认为促炎细胞因子(TNF-α、IL-6等)在炎性衰老发生发展中起着核心作用[6]。本研究旨在观察AngⅡ是否可以诱导体外培养的HUVECs衰老，以及其中IL-6、TNF-α分泌的变化，并探讨炎症因子在炎性衰老致AS中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 人脐静脉血管内皮细胞株HUVECs由广州军区广州总医院医学实验科提供;DMEM培养基、胎牛血清、AngⅡ、CCK-8购自美国Sigma公司;细胞周期流式细胞分析试剂盒、细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶检测试剂盒购自上海碧云天生物试剂公司;人IL-6、人TNF-αELISA试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司，倒置显微镜(Olympus公司，日本);酶标仪(Tecan Genios，瑞士);流式细胞仪(Miltenyi公司，德国)。

1.2 人脐静脉内皮细胞的培养和鉴定 HUVECs细胞株贴壁生长于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，每2～3 d换液1次维持细胞良好生长状态。待细胞长至融合时用0.25%胰蛋白酶消化、传代。HUVECs呈多角形，单层铺路石样紧密排列。

1.3 CCK-8法检测细胞存活率 将细胞以5000个/孔接种于96孔板中，每孔加100μl培养液置培养箱过夜，弃去培养液后，对照组(5孔)每孔加入100μl培养液，实验组(每组5孔)加入含不同浓度(10－8、10－7、10－6和10－5mol/L)Ang Ⅱ100 μl培养液置培养箱培养48 h，终止培养前向每孔加入CCK-8 20μl培养1 h，酶联免疫检测仪在450 nm下测定各孔OD值，以药物组与对照组OD值百分比代表细胞增殖率。每组设5复孔，重复3次。

1.4 衰老细胞鉴定 细胞长至亚融合后，无血清同步12h，加入终浓度为10－6mol/L AngⅡ，持续刺激48 h，第12 h、24 h各补充AngⅡ 1次即为AngⅡ诱导的HUVECs衰老模型。对照组为不含AngⅡ上述培养液培养48 h。

1.4.1 β-半乳糖苷酶染色:根据细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒操作方法，将原培养板里的培养液弃去，PBS清洗细胞1次，每孔加入SA-β-gal染色固定液1 ml，室温固定15 min。吸除固定液后PBS洗3次，每次3 min。每孔加入染色工作液1 ml，37℃无CO2条件下孵育过夜。用保鲜膜将六孔板封住以防止蒸发。荧光显微镜下每组标本随机选取5个视野，胞浆蓝染者为阳性细胞即衰老细胞，计算阳性细胞占观察细胞总数的百分比。

1.4.2 细胞周期分析:收获的细胞冷乙醇4℃固定过夜。取5×106细胞，1000 r/min离心弃乙醇，PBS洗2遍;加入碘化丙啶(PI)染液，4℃避光孵育30 min。过筛后立刻上机检测进行细胞流式周期分析。

1.5 双抗体夹心ELISA检测上清中IL-6、TNF-α浓度按照上述方法诱导细胞衰老后，取细胞培养液上清离心，再收集上清置于－20℃保存，然后按人IL-6、人TNF-αELISA试剂盒说明书操作，置于酶标仪在450 nm处测定吸光度，每组设3复孔，重复2次。

1.6 统计学分析 采用SPSS 15.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差(珋)表示，计量资料比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞存活率CCK-8法检测表明，经不同浓度AngⅡ培养 HUVECs 48 h 后，10－8和 10－7mmol/L Ang Ⅱ组细胞存活率与对照无明显差异(P＞0.05);10－6和10－5mmol/L AngⅡ组存活率有统计学差异(P＜0.01)。10－5mmol/L AngⅡ在48 h即引起细胞生长停滞，增殖率降低，从而可能因浓度过高而导致细胞凋亡或坏死，不能诱发细胞衰老;10－8和10－7mmol/L AngⅡ在48 h内仍未引起明显的细胞生长停滞，从而可能因浓度过低不至于引起细胞衰老;10－6mol/L AngⅡ组细胞存活率为(77.15±1.85)%，故本实验选用10－6mol/L AngⅡ建立HUVECs衰老模型。

2.2 衰老细胞鉴定

2.2.1 SA-β-gal活性:SA-β-gal化学染色阳性细胞的胞浆和胞核呈蓝染。染色后对照组几乎不表达β-gal，AngⅡ诱导组β-gal阳性细胞数明显增加，约80%细胞染色阳性(图1)。

图1 AngⅡ对HUVECs SA-β-gal活性的影响

2.2.2 细胞周期分析:细胞增殖能力下降是衰老的另一个生物学标志，而细胞周期可以反映细胞的增殖能力。流式细胞术分析结果显示，对照组HUVECs的各期比例正常，AngⅡ诱导大部分细胞停滞于G0/G1期，S期及G2/M期趋于消失，与对照组比较，各周期的细胞比例差异有统计学意义(P＜0.01)。见表1。表明诱导组细胞生长逐渐停滞，细胞增殖能力明显下降。

表1 AngⅡ对细胞周期的影响(，%)

表1 AngⅡ对细胞周期的影响(，%)

注:与对照组比较，＊＊P＜0.01

组别 样本数(个) G0/G1期 S期 G2/M期对照组5 49.5±5.5 31.0±5.3 19.4±1.7 AngⅡ诱导组 5 89.4±3.4＊＊8.0±3.1＊＊2.0±1.5＊＊

2.3 AngⅡ对HUVECs培养液中IL-6、TNF-α分泌的影响 正常对照组有一定基础量的IL-6、TNF-α分泌，经AngⅡ诱导后 IL-6、TNF-α分泌显著增加(P＜0.01)，但IL-6较对照组上升超过2倍，而TNF-α仅为1倍左右。

表2 AngⅡ对炎症因子的影响(，%)

表2 AngⅡ对炎症因子的影响(，%)

注:与对照组比较，＊＊P＜0.01

组别 样本数(个) IL-6 TNF-α对照组575±31 32±19 AngⅡ诱导组 5 178±28＊＊ 58±23＊＊

3 讨论

在过去的几十年，我们对AS发病机制的理解经历了一场革命[7]，由先前被认为主要是管道问题、退行性疾病，转变为一种多因素导致的炎症反应性疾病[8-9]。衰老是AS的独立危险因素，AS的发生率随增龄急剧上升[10]。而炎性衰老是衰老研究领域的一个新成员，目前血管紧张素系统在血管衰老机制研究中逐渐被重视，AngⅡ信号级联反应随衰老增加，最终促进AS的发展，抑制AngⅡ的活性已被证明能降低心血管疾病的发病率和病死[11]。最近研究表明，AngⅡ可通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)激活导致血管内皮细胞衰老[12]。故本文用 AngⅡ诱导 HUVECs为衰老模型[13]，研究体外细胞复制衰老过程中IL-6、TNF-α 分泌的变化。

AngⅡ是诱导细胞衰老的一种常用物质，我们以目前公认的衰老标志物:SA-β-gal和细胞的增殖能力为主要观察指标，对AngⅡ诱导HUVECs衰老的可能性进行观察。阮云军等[14]用过氧化氢诱导血管平滑肌细胞衰老，观察到G1期细胞比例和SA-β-gal染色阳性细胞百分比增加。本实验结果表明AngⅡ诱导HUVECs 48 h后出现了衰老的表型，SA-β-gal活性和停滞在G0/G1期的比例明显升高，说明AngⅡ已成功诱导 HUVECs衰老模型，可用于细胞衰老机制的研究。

炎症贯穿于AS发生和发展的全过程，大量炎症因子对AS的形成和发展发挥了至关重要的作用[15]。IL-6影响多种细胞的生长、分化或基因表达，活化的内皮细胞可以产生大量的IL-6，IL-6也刺激内皮细胞的增生，增加内皮细胞的血管生成能力[16];IL-6可以直接损伤内皮细胞，增加内皮细胞的通透性[17];还可以上调内皮细胞黏附分子的表达，增加内皮细胞及血液中淋巴细胞黏附能力[18]。TNF-α具有广泛的生物学活性，其在AS和炎症中发挥作用。循环中的TNF-α的水平同年龄相关AS的危险成正相关[14]。TNF-α可以抑制一氧化氮合酶的生成，诱导血管内皮细胞的凋亡及刺激内皮细胞表达黏附分子，导致内皮功能障碍[19];并且还可以刺激炎症因子生成，直接发挥促炎作用[20]，从而加速AS的形成和发展。周建军等[21]研究表明TNF-α可能通过影响线粒体功能而诱导血管内皮细胞衰老。老年人血清中IL-6和TNF-α水平的升高与疾病、残疾和死亡率有关。对大量人群的研究表明血清IL-6水平可作为老年人功能残疾的可靠标志，也可作为老年人炎性衰老的预测指标[22]。从对健康老年人研究发现，衰老与高炎症反应状态相关。高炎症反应状态的原因是循环中促炎症细胞因子介质，包括IL-1、IL-6、TNF-α和前列腺素2(PGE2)水平的升高[23-24]。本研究表明，AngⅡ诱导组比正常对照组IL-6、TNF-α分泌明显增加(P＜0.01)，但IL-6较对照组上升＞2倍，而TNF-α仅为1倍左右，与文献报道一致。

炎症细胞因子网络贯通于炎症和衰老网络，探讨炎性衰老的炎症因子网络调控新机制，是研究炎性衰老的新策略[25]。有研究表明，促炎细胞因子能诱导细胞衰老。DNA损伤激活核因子-κB(NF-κB)等信号通路产生促炎细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8等)，从而阻滞细胞周期，诱导和维持细胞衰老表型[26]。促炎细胞因子(如 TNF-α、IFN-β、IFN-γ 等)通过产生活性氧和激活ATM/p53/p21(WAF1/Cip1)信号通路诱导上皮细胞衰老[27]。综上所述，AngⅡ可以诱导 HUVECs衰老，其机制可能与IL-6、TNF-α分泌增加有关，但其具体的分子机制有待进一步研究。

[1]Minamino T，Yoshida T，Tateno K，etal.Ras in-duces vas-cular smooth m uscle cell senescence and inflammation in human atherosclerosis[J].Circulation，2003，108(18):2264-2269.

[2]Zahradka P，Werner JP，Buhay S，etal.NF-kappaB activation is essential for angiotensin II-dependent proliferation and migration of vascular smooth muscle cells[J].JMol Cell Cardiol，2002，34(12):1609-1621.

[3]Franceschi C，BonafèM，Valensin S，etal.Inflamm-aging.An evolutionary perspective on immunosenescence[J].Ann NY Acad Sci，2000，908:244-254.

[4]Franceschi C，Valensin S，Lescai F，etal.Neuroinflammation and the genetics of Alzhelmer's disease:the search for a proinflamatory phenotype[J].Aging(Milarno)，2001，13(3):163-170.

[5]夏世金，刘小雨，黄建华，等.炎性衰老的研究进展[J].中华老年医学杂志，2007，26(7):550-553.

[6]Salvioli S，CapriM，Valensin S，etal.Inflamm-aging，cytokines and aging:state of the art，new hypotheses on the role ofmitochondria and new perspectives from systems biology[J].Curr Pharm Des，2006，12(24):3161-3171.

[7]Libby P，Theroux P.Pathophysiology of coronary artery coronary artery disease[J].Circulation，2005，111(25):3481-3488.

[8]Stoll G，Bendszus M.Inflammation and atherosclerosis novel insights into plaque formation and destabilization[J].Stroke，2006，37(7):1923-1932.

[9]Jawien J.New insights into immunological aspect of atherosclerosis[J].Pol Arch Med Wewn，2008，118(3):127-131.

[10]Lakatta EG，Levy D.Arterial and cardiac aging:major shareholders in cardiovascular disease enterprises part I:aging arteries:a"set up"for vascular disease[J].Circulation，2003，107(1):139-146.

[11]Najjar SS，ScuteriA，Lakatta EG.Arterialaging:is itan immutable cardiovascular risk factor?[J].Hypertension，2005，46(3):454-462.

[12]Shan HY，Bai XJ，Chen XM.AngiotensinⅡ induces endothelial cell senescence via the activation ofmitogen-activated protein kinases [J].Cell Biochem Funct，2008，26(4):459-466.

[13]王雪妮，刘凌，刘泽.不同浓度血管紧张素Ⅱ对人脐静脉血管内皮细胞衰老和P选择素表达的影响[J].实用老年医学，2011，25(5):393-395.

[14]阮云军，吴赛珠，邱健，等.活性氧诱导血管平滑肌细胞衰老及脱氢表雄酮的干预研究[J].中华老年医学杂志，2010，29(2):154-157.

[15]Kleemann R，Zadelarr S，Kooistra T.Cytokines and atherosclerosis acomprehensive review of studies in mice[J].Cardiovase Res，2008，79(3):360-376.

[16]Fee D，Grzybicki D，Dobbs M，etal.Interleukin 6 promotes vasculogenesis ofmurine brain microvessel endothelial cells[J].Cytokine，2000，12(6):655-665.

[17]Maruo N，Morita I，Shirao M，etal.IL-6 increases endothelial permeability in vitro[J].Endocrinology，1992，131(2):710-714.

[18]Watson C，Whittaker S，Smith N，etal.IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes[J].Clin Exp Immunol，1996，105(1):112-119.

[19]Zhang H，Park Y，Wu J，etal.Role of TNF-alpha in vascular dysfunction[J].Clin Sci(Lond)，2009，116(3):219-230.

[20]Popa C，Netea MG，van Riel PI，etal.Role of TNF-alpha in chronic inflammatory conditions，intemediarymetabolism，and cardiovascular risk[J].JLipid Res，2007，48(4):751-762.

[21]周建军，高云飞，王红芳，等.TNF-α诱导血管内皮细胞的衰老[J].科学通报，2001，19(46):1636-1640.

[22]DeMartinis M，Franceschi C，Monti D，etal.Inflamm-ageing and lifelong antigenic load asmajor determinants of ageing rate and longevity [J].FEBS Lett，2005，579(10):2035-2039.

[23]Adams AA，Breathnach CC，KatepalliMP，etal.Advanced age in horses affects divisional history of T cells and inflammatory cytokine production [J].Mech Ageing Dev，2008，129(11):656-664.

[24]Cesari M，Penninx BW，Pahor M，etal.Inflammatory markers and physical performance in older persons:the InCHIANTI study[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2004，59(3):242-248.

[25]夏世金.炎性衰老研究的现状和新策略[J].实用老年医学，2010，24(1):7-9.

[26]Bartek J，Hodny Z，Lukas J.Cytokine loops driving senescence[J].Nat Cell Biol，2008，10(8):887-889.

[27]Sasaki M，Ikeda H，Sato Y，etal.Proinflammatory cytokineinduced cellular senescence of biliary epithelial cells ismediated via oxidative stress and activation of ATM pathway:a culture study[J].Free Radic Res，2008，42(7):625-632.