银杏酚对SMMC-7721肝癌细胞和荷H22肝癌小鼠的抗癌作用

王云飞，杨小明，李月英，李洁，黄炳忠，郭婵元，易楠，刑朝晖

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013;2.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013;3.镇江市丹徒区人民医院内科，江苏镇江212028;4.江苏大学化学化工学院，江苏镇江212013)

银杏酚和银杏酸同为银杏中存在的烷基酚类化合物，两者结构相近，均在苯环上连接有1个酚羟基和1个长度为13到17碳的烷基侧链，其差异仅为前者比后者在苯环上少连接1个羧基。两者都存在于银杏的叶、果和外种皮中，但银杏酚的含量仅为银杏酸的1/10。由于烷基酚类化合物具有接触性过敏特点，因此，国际上要求银杏叶标准提取物(EGb761)中该类化合物的含量要低于1×10－5mg/g，甚至 5 ×10－6mg/g［1］。此外，银杏酸还具有杀菌、杀虫和抗肿瘤等活性作用，可进一步研发为杀菌剂、杀虫剂和抗肿瘤药物［2－5］。目前，人们对银杏烷基酚类化合物的研究主要局限于银杏酸，而对银杏酚的研究并不多。本课题组在前期对银杏酸研究的基础上，制备出银杏酚同系物并对其进行了结构鉴定［6］，在此基础上，进一步研究银杏酚对体外SMMC-7721肝癌细胞生长的抑制作用和对体内荷H22肝癌小鼠瘤体生长的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物与试剂 银杏酚按照文献［6］制备并鉴定，由银杏酚 C13∶0，C15∶0，C15∶1，C17∶1和C17∶2等5个同系物组成，含量大于95%。DMEM和 RPMI1640、胎牛血清购自 Gibco公司;MTT购自美国Sigma公司;药物注射用环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)购自通化茂祥制药有限公司，批号:111101。其余试剂均为分析纯，购自上海国药集团，使用前未再进行处理。

1.1.2 肿瘤细胞株 人肝癌SMMC-7721细胞株由中科院上海细胞所提供，江苏大学基础医学与医学技术学院冻存;小鼠肝癌H22瘤株由苏州大学惠赠。

1.1.3 实验动物 清洁级昆明种小鼠，体质量(20±2)g，雌雄各半，由江苏大学实验动物部提供，合格证号:SCXK(苏)2009-0002。独立隔离饲养，环境温度为(20±1)℃，湿度60% ～70%，每天自然光照12 h，自由进食，饮水。

1.1.4 实验仪器 电子分析天平(美国奥豪斯公司)，MQX200型紫外可见光全自动扫描酶标仪(美国BIO-TEK公司)，ABX PENTRA60血液分析仪，SW-CJ-1FD型单人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)，Forma CO2细胞培养箱(美国Forma Sicentific公司)，Tomos 900B台式离心机(上海托莫斯科学仪器有限公司)，XD-202倒置式生物显微镜及数码摄像系统(江南仪器)，PYX-DHS-40X50B隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，ULT1386-3-V40超低温冰箱(美国Thermo Scientific Revco公司)，TH-3560高压灭菌锅［造鑫(鑫科)企业有限公司］。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤细胞培养 SMMC-7721细胞株用DMEM常规传代培养;H22肝癌细胞株用RPMI1640培养。2种细胞培养液中均含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素，于37℃ 5%CO2培养箱内传代培养。

1.2.2 银杏酚对SMMC-7721细胞抑制作用 采用MTT法［7］测定银杏酚对SMMC-7721细胞的抑制作用。取对数生长期SMMC-7721细胞，调整密度为5×104/mL，混匀，于 96 孔板加细胞悬液 100 μL/孔。待细胞贴壁后，分别加入不同质量浓度的银杏酚处理24、48和72 h后，每孔加入10 μL 5 g/L的MTT(PBS)溶液，于细胞培养箱继续避光孵育4 h，小心吸去培养液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，轻微振荡10 min后，于酶标仪上测570 nm处光密度，每孔设6个复孔，平行测定3次。按下面公式计算抑制率，SPSS 16.0软件计算银杏酚的半数抑制浓度IC50。抑制率=(对照组光密度值－治疗组光密度值)/(对照组光密度值－空白组光密度值)×100%。

1.2.3 银杏酚对小鼠H22肿瘤生长的抑制作用参照文献［7］方法，取对数生长期H22细胞无菌腹腔注射小鼠，以小鼠腹腔积液传代，每7天传1代。选择第2代生长旺盛，且无溃破的健康H22荷瘤小鼠，颈椎脱位法处死小鼠，于超净工作台无菌抽取乳白色腹腔积液，用无菌生理盐水1∶3稀释后接种于健康小鼠右前肢腋部皮下，每只0.2 mL。

于接种次日随机分组，每组8只，雌雄各半。设不接种腹腔积液的小鼠为正常对照组。小鼠接种24 h后，银杏酚处理组于腹腔注射不同质量浓度的银杏酚(分别为20，40，80和160 mg/kg);环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺(2 mg/kg)，作为阳性对照;模型对照组腹腔注射生理盐水，0.2 mL/只;1次/d，均连续注射7 d。于末次给药后24 h(禁食不禁水)，分别称重，眼眶取血于抗凝管中用于血细胞计数;然后迅速颈椎脱臼处死小鼠，剥离瘤体、脾脏和胸腺，分别称重，并按下面公式计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数。胸腺指数=胸腺质量(mg)/体质量(g);脾指数=脾质量(mg)/体质量(g);抑瘤率=［对照组小鼠平均瘤质量(g)－用药组小鼠平均瘤质量(g)/对照组小鼠平均瘤质量(g)］×100%。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行数据处理和分析。数据均以均数±标准差(±s)和百分数表示，多组间均数比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银杏酚对体外SMMC-7721细胞增殖的抑制作用

分别测定了不同质量浓度银杏酚处理SMMC-7721细胞24、48和72 h对细胞增殖的抑制作用，见图1。

由图1a可见，在0～50 mg/L质量浓度范围内，随着浓度增加，银杏酚对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用显著增强，质量浓度与抑制率呈正相关，质量浓度-抑制率曲线呈现出一段陡的直线;银杏酚质量浓度为50～100 mg/L时，质量浓度变化对SMM-7721抑制率无明显影响，质量浓度-抑制率曲线出现一小平台;银杏酚质量浓度为200～400 mg/L时，细胞抑制率与质量浓度呈负相关。因此，将银杏酚的质量浓度范围调整为0～30 mg/L。图1b为银杏酚质量浓度为0～30 mg/L时处理SMMC-7721细胞24，48和72 h后的生长抑制率曲线。由图1b可见，SMMC-7721细胞的抑制率随着银杏酚质量浓度的增加而显著增加。以质量浓度为15 mg/L的银杏酚处理SMMC-7721细胞72 h，抑制率已接近100%。银杏酚作用于 SMMC-7721细胞24、48和72 h的半数抑制质量浓度 IC50分别为(15.33±1.19)、(12.20 ±1.08)和(10.88 ±1.03)mg/L。结果表明，银杏酚对体外SMMC-7721肝癌细胞的增殖有显著抑制作用，并呈明显的量效和时效正相依赖关系。

图1 银杏酚对体外人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用Fig 1 Inhibitory effects of ginkgols on SMMC-7721 cells in human hepatic carcinoma cell lines

2.2 银杏酚对小鼠H22肿瘤生长的影响

结果见表1，银杏酚20 mg/kg组(P=0.83)和40 mg/kg组(P=0.14)的小鼠体质量与模型对照组比较，差异均无统计学意义;但存活率远高于模型对照组和环磷酰胺组(P均＜0.05)。银杏酚20 mg/kg组(P ＜0.01)和 160 mg/kg组(P=0.027)的抑瘤率明显低于环磷酰胺组;而40 mg/kg组的抑瘤率与环磷酰胺组比较，差异无统计学意义(P=0.667);80 mg/kg组的抑瘤率明显高于环磷酰胺组(P=0.048);由此可以看出，银杏酚体内的抑瘤作用与体外对细胞生长的抑制作用呈现相同的趋势，即随着剂量的增加，抑瘤率逐渐增大;剂量过高抑瘤率反而有所下降。综合银杏酚对小鼠体质量、存活率、抑瘤率的影响，其剂量为40 mg/kg时效果最好。

表1 各组小鼠的基本情况比较±sTab 1 Comparison of basic values in different groups

表1 各组小鼠的基本情况比较±sTab 1 Comparison of basic values in different groups

a∶P ＜0.05，与模型对照组比较;b∶P ＜0.05，与环磷酰胺组比较

/%模型对照组 24.28 ±0.74 50.00 0.540 5 ±0.016 2组别 体质量/g 存活率/% 瘤质量/g 抑瘤率—环磷酰胺组 28.78 ±1.71a 62.50 0.308 4 ±0.090 4a 42.94银杏酚组 20 mg/kg 24.12 ±1.20 75.00 0.492 1 ±0.042 9b 8.96b 40 mg/kg 25.68 ±1.54 82.50 0.325 3 ±0.030 9a 39.81 80 mg/kg 19.83 ± 0.35a 75.00 0.278 3 ±0.022 7a，b 48.51b 160 mg/kg 22.22 ± 1.16 50.00 0.387 2 ±0.028 8a，b 28.36b F/χ2 值 3.48 42.26 3.86 44.82 P值0.99 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 银杏酚对荷H22小鼠免疫器官指数及免疫细胞数的影响

与模型对照组比较，银杏酚4个组的胸腺指数均明显降低(P均＜0.05)。就脾指数而言，差异无统计学意义，见表2。

表2 各组小鼠胸腺指数和脾指数的比较±sTab 2 Comparison of spleens index and thymus index in different groups

表2 各组小鼠胸腺指数和脾指数的比较±sTab 2 Comparison of spleens index and thymus index in different groups

a:P ＜0.05，与模型对照组比较;b:P ＜0.05，与环磷酰胺组比较

组别 胸腺指数 脾指数模型对照组6.52 ±0.42 5.64 ±1.22环磷酰胺组 3.81 ±0.32a 6.47 ±1.03银杏酚组 20 mg/kg 4.75 ±0.39a 6.04 ±1.15 40 mg/kg 2.06 ±0.18a，b 6.29 ± 0.91 80 mg/kg 0.60 ±0.09a，b 7.21 ± 1.05 160 mg/kg 0.67 ±0.13a，b 4.89 ± 0.45 F 值 4.311 0.029 P值 ＜0.01 0.251

银杏酚治疗后荷瘤小鼠外周血淋巴细胞计数如图2所示。

图2 各组小鼠的外周血淋巴细胞计数比较(×109/L)Fig 2 Comparison of lymphocyte levels from peripheral blood in different groups

模型对照组淋巴细胞数略低于环磷酰胺组，差异无统计学意义(t=4.860，P ＞0.05);较正常组有所升高，差异有统计学意义(t=9.346，P ＜0.05)。银杏酚组淋巴细胞数与模型对照组、正常对照组和环磷酰胺组比较，均有明显升高(P均＜0.05);其中，以 40 mg/kg和 80 mg/kg组 尤 为 明 显(P＜0.01)，说明不同质量浓度的银杏酚能不同程度地增加外周血中的淋巴细胞数，提高荷瘤小鼠的免疫功能。

3 讨论

银杏酚是银杏叶、果和外种皮中存在的天然活性成分。本研究采用MTT法研究了银杏酚对体外SMMC-7721细胞活性的影响。分别从时间和剂量关系两个方面比较了银杏酚对体外SMMC-7721细胞生长的抑制作用。银杏酚作用SMMC-7721细胞24、48和72 h 的 IC50分别为(15.33 ±1.19)，(12.20 ±1.08)、(10.88 ±1.03)mg/L。结果表明，在 0 ～30 mg/L范围内，银杏酚对SMMC-7721肝癌细胞的增殖有显著抑制作用，并呈明显的量效和时效正相关。银杏酚质量浓度过高对SMMC-7721细胞的抑制率反而下降。

为进一步证实银杏酚对体内肝癌实体瘤的抑制作用，本研究建立H22荷瘤小鼠模型，分别用20，40，80和160 mg/kg的银杏酚治疗荷瘤模型。结果表明，银杏酚对小鼠体内H22实体瘤有一定的抑制作用，在20～80 mg/kg范围内，呈现剂量与效果的依赖关系，但质量浓度达到160 mg/kg时，抑制率反而下降。体内抑瘤作用与体外抑制细胞的生长作用呈现相同的倒“U”形趋势。综合抑瘤率、存活率、体质量变化以及荷瘤小鼠日常精神状态，银杏酚体内治疗H22荷瘤小鼠的最适剂量为40 mg/kg。

此外，银杏酚组的H22荷瘤小鼠胸腺指数随着药物质量浓度的增加逐渐减小。胸腺是机体内重要的免疫器官之一，正常情况下会随着年龄的增长而逐渐减小。本研究中银杏酚组荷瘤小鼠胸腺指数的降低可能是由银杏酚促进荷瘤小鼠免疫系统的发育以及胸腺内成熟引起的［8］。从脾指数变化可看出，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

通过检测银杏酚治疗荷瘤小鼠后其外周血淋巴细胞数的变化(图2)发现，银杏酚对荷瘤H22小鼠的免疫系统不仅没有明显的不良反应，而且还能显著提高荷瘤小鼠的免疫功能，表现为荷瘤小鼠淋巴细胞数的显著升高。由于淋巴细胞在肿瘤治疗过程中发挥着重要作用［9－10］，相对于 Ben-Efraim［10］和李墨林［11］对抗肿瘤药物的分类，银杏酚很可能是依赖于T淋巴细胞的抗肿瘤药物。大剂量药物通常对机体的免疫功能起抑制作用，相比之下，小剂量药物可激活或提高机体的抗肿瘤免疫力［10－11］。或许银杏酚可作为一种小剂量抗肿瘤辅助药物。

银杏酚酸具有广泛的生物活性，目前国内银杏叶制剂和银杏保健食品等已有市面产品。但不可忽视的是，烷基酚酸类化合物在表现出理想的生物活性的同时，如抑菌、抗肿瘤等，还有一定的致敏及细胞毒作用［12］。如何在保证在安全剂量范围内，最大限度地利用银杏酚酸的生物活性，还有待于深入研究。本文中初步阐述了银杏酚的抗肿瘤作用，能否在临床上发挥良好效果，还有待于进一步研究。

［1］ van Beek TA.Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts［J］.J Chromatogr，2002，967(1):21 －55.

［2］ 杨小明，陈钧，钱之玉，等.银杏酸抑菌效果的初步研究［J］.中药材，2002，25(9):651－653.

［3］ 杨小明，陈盛霞，张蓉仙，等.银杏外种皮石油醚提取物的杀钉螺活性研究［J］.中国人兽共患病学报，2006，22(10):961 －964.

［4］ 杨小明，陈永昌，陈钧.银杏中银杏酸诱导人白血病细胞 U937凋亡的研究［J］.食品科学，2006，27(9):241－246.

［5］ 叶思思，高静，龚爱华，等.线粒体参与银杏酸诱导HepG2细胞凋亡的研究［J］.南京大学学报:自然科学版，2012，48(3):360－366.

［6］ 杨小明，刘方，龚爱华.一种白果酚的制备方法:中国，CN200810234282.6［P］.2009-08-26.

［7］ 徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.3版.北京:人民卫生出版社，2002:181－190，1758－1786.

［8］ 侯元，霍德胜，魏艳君，等.草苁蓉多糖的抗肿瘤作用及免疫调节作用［J］.吉林大学学报:医学版，2007，33(6):1022－1025.

［9］ 李墨林，李传刚，舒晓宏，等.化疗治愈荷瘤小鼠模型的建立及氟尿嘧啶抑制瘤作用的免疫机制［J］.细胞与分子免疫学杂志，2007，23(11):1010－1013.

［10］ Ben-Efraim S.Immunomodulating anticancer alkylating drugs:targets and mechanisms of activity［J］.Curr Drug Targets，2001，2(2):197 －212.

［11］ 李墨林.化疗治愈肿瘤动物模型的建立及小剂量CTX抗肿瘤作用机制的研究［D］.辽宁:大连医科大学，2008.

［12］ 杨小明，陈钧，钱之玉.烷基酚酸的生物活性研究进展［J］.中草药，2003，34(5):5 －6.