电化学生物传感器在环境监测中的应用及发展前景

娄童芳，邢欢欢，屈建莹

(河南大学 化学化工学院 环境与分析科学研究所，河南 开封 475004)

随着工、农业的快速发展，产生了大量的有机和无机污染物，这些物质的无序排放造成的环境污染和生态资源破坏将制约着国家和地区的发展，影响普通大众的生活环境．因此，环境保护已经成为当今世界的热点问题之一. 对环境污染物进行实时、在线、原位监测，并且提高分析测试方法的灵敏度、稳定性和便携性, 已经成为当今环境监测所追求的目标．国家标准中污染物分析检测方法常用的有：理化分析法、分光光度法、气相色谱法、气-质联用法和液相色谱法等，但是这些方法操作复杂、试剂消耗量大，因而不能适应环境现场监测和在线监测．

电化学生物传感器是一门综合了多门学科的高新技术，由于生物分子的特异性，对各类环境污染物的检测分析具有灵敏度高、选择性好、稳定性好、重现性好和成本低等优点，被广泛应用于环境监测领域，并引起人们越来越多的关注．

1 电化学生物传感器及其工作原理

电化学生物传感器是基于被测物的电化学性质，并将被测物的化学量转换成电学参量进行检测的一种传感器，主要由两部分组成：一部分是生物分子识别元件，是由对被测物具有高选择性分子识别功能的生物敏感功能膜组成，可用来制作生物感应元件的物质有酶、细胞、组织、核酸、抗原抗体等，其主要作用是用来感知样品中是否含有待测物质；另一部分是信号转换元件，按照信号转换元件所转换的电学参量的不同，主要包括电位型传感器、电流型传感器和电导型传感器等．原则上讲，任何一种接收器都可与适应的传导器结合起来制造出具有操作性能的传感器[1]．

电化学生物传感器的设计原理是待测物与生物分子识别原件特异性结合后，产生被测物的非电信号通过信号转换器转换成可测量的电信息，再经过信号放大处理，最后输出信号，从而达到分析检测的目的[2]．

2 电化学生物传感器在环境监测中的应用

2.1 水环境污染物的监测

在环境监测中，生物传感器应用最多的是水质分析，例如在待测水源处放置一个经特殊制作的电化学生物传感器及其附件达到现场监测的目的. 利用传感器的方法不需要试剂并省去了送样的费用，因此操作方便、成本低．

2.1.1 用于监测BOD的电化学生物传感器[3]

生化需氧量(BOD)是衡量水体有机污染程度的重要指标，在水污染控制中具有重要作用．即当水中所含有机物与空气接触时，由于需氧微生物的作用而分解使之无机化或气体化时所需消耗的氧气量(单位mg·L-1)．常规的BOD测定是用稀释与接种法来测定，需要5 d的培养期，操作复杂、重复性差、耗时耗力、干扰性大、不能满足对污染水体在线监测的要求[4]，所以迫切需要开发一些操作简单、快速准确、自动化程度高、抗干扰能力强的新方法．

BOD电化学传感器最主要的就是BOD微生物电极，将微生物的单一菌种或混合种群制作成敏感膜固定于电极上．常用于制作BOD电化学生物传感器的微生物有酵母、假单胞菌、芽孢杆菌、发光菌和嗜热菌等．由于水体中BOD物质的加入或降解代谢的发生，使水中的微生物内外源呼吸方式发生转化或变化，导致电信号强弱的改变．通常，在适宜的BOD浓度范围内，传感器输出的电流值与样品中BOD的浓度呈线性关系．BOD传感器不仅能满足实际监测的要求，并且有灵敏快速的特点．

目前，国外两种新的酵母菌种SPT1和SPT2已被分离出来，并被固定在玻碳电极上，在葡萄糖和谷氨酸的培养基上，以铁氰化物为电子传导中介，构成用于测量BOD的微生物传感器，其重现性为±10%．如将该传感器用于测量纸浆厂污水中BOD浓度，在5 min内其最小值可达到2 mg·L-1 [5]．

胡磊等[6]使用接枝二茂铁为介体的微生物电化学传感器测量污水中的BOD含量．以二茂铁(Fc)为介体，通过缩合反应将其接枝到大分子介孔材料SBA-15表面形成Fc-SBA-15，然后将活性污泥提取微生物与Fc-SBA-15介体悬浊液和聚乙烯醇(PVA)溶胶进行混合包埋．以此制备成的微生物敏感膜，保持了Fc介体传递电子速度快和电化学反应低电势的优点．将该微生物敏感膜与玻碳电极耦合，构成三电极系统，实现了对污水水样中的BOD含量快速测量．结果表明，传感器的线性范围在2～300 mg·L-1，精密度和抗干扰能力强，并能用于实际水样的监测．

2.1.2 用于酚类物质的监测

酚类化合物是一类应用广泛的化工原料，主要出现在造纸、合成氨、炼油、炼焦、煤气洗涤、木材防腐和化工等废水中，各国普遍采用4-氨基安替比林光度法分析这一类高毒物质，但油类、硫化物、芳香胺类等会干扰测定[7]．用电化学生物传感器测定酚类化合物则具有灵敏、准确且选择性高的优点，常用的有酶电极、微生物电极和植物组织电极．

酚类化合物能够被酪氨酸酶催化氧化[8]，并产生相应的电化学信号．ZnO溶胶凝胶和酪氨酸酶等电点存在差异，前者具有较高等电点(约为9.5)[9]，容易通过静电吸附作用吸附低等电点的酪氨酸酶(等电点大约为4.5)[10]．刘志敏[11]等以此构建了酪氨酸酶电化学生物传感器，其对苯酚的检出限达到8.0×10-8mol·L-1，达到95%稳态电流所需时间小于10 s，并且表现出良好的重现性、稳定性和准确性，能抵抗天冬氨酸、谷氨酸、乙酰氨基苯酚等物质的干扰．此外，刘志敏[12]课题组针对酪氨酸酶构建了一种简单有效的酚类化合物传感器，该传感器对邻苯二酚、苯酚和对甲基苯酚的检出限依次为3.2×10-7、6.0×10-7和1.8×10-7mol·L-1．

由于酚类反应需要大量的氧，因此也可以将酪氨酸酶或富含酪氨酸酶的新鲜植物组织切片与溶氧电极结合制成测定酚的电化学生物传感器．穆东燕等[13]利用麦芽糊精修饰的碳糊电极构建了电流型酪氨酸酶生物传感器，该传感器对苯酚浓度在2.0×10-7～1.0×10-5mol·L-1的范围内呈线性关系，响应时间为2 min．此传感器对其他酚类物质如: 邻苯二酚, 邻甲酚, 对氯苯酚等都有良好的响应，可以实现对工业废水中酚类物质的浓度监测．

漆酶(Lac)是一种含有4个铜离子的多酚氧化酶，可以存活于空气中，发生反应后的唯一产物是水，因而是一种环保酵素[14]，也常被固定于电极上实现酚类物质的检测[15-17]．当还原态的漆酶与氧气接触时，被氧化为氧化态漆酶，氧化态漆酶进一步将邻苯二酚氧化成醌，最后醌在电极表面发生还原反应，据此可以根据峰电流的变化计算邻苯二酚的浓度，其作用机理如图1所示.

图1 漆酶生物传感器催化机理Fig.1 Catalytic mechanism of laccase biosensor

RAWAL等[18]利用MnO2NPs/cMWCNTs/PANI修饰Au电极，将漆酶共价固定到修饰电极上，制备了漆酶生物传感器．该传感器的最适宜使用条件是pH=5.5,0.1 mol·L-1的醋酸钠缓冲溶液中和35 ℃条件下，对酚的检出限能够达到4×10-8mol·L-1，响应时间为4 s，并能检测茶叶中总酚的含量，在5个月内可以进行150次测定．RAHMA等[19]利用高分子聚合物和纳米金固定漆酶，构建的漆酶电化学生物传感器用于对邻苯二酚的测定，线性范围为1×10-7～1 ×10-5mol·L-1．

2.1.3 用于阴离子表面活性剂的监测

阴离子表面活性剂广泛应用在日常生活和工业生产中，大量的阴离子表面活性剂进入水体中可引起水质的恶化，如直链烷基苯磺酸钠(LAS)可造成严重的水污染，消耗溶解氧，并在水面产生不易消失的泡沫．NOMURA[20]等人研制出一种由LAS降解细菌和氧电极组成的，用来探测阴离子表面活性剂浓度的电化学生物传感器．当阴离子表面活性剂存在时，LAS降解细菌的呼吸作用增加，导致溶解氧变化，根据氧电极电流的变化判断LAS的浓度．

2.1.4 用于硝酸盐的监测

2.1.5 用于硫化物的监测

硫化物的毒性较大，易产生硫化氢，造成严重的环境污染．焦化、选矿、造纸、印染和制革等工业废水通常含有硫化物，包括溶解性的H2S、HS-和S2-，酸溶性的金属硫化物等．因此，硫化物是水体污染的重要指标．

应用硫化杆菌微生物膜检测S2-的作用机理为：微生物电极在温度、体积及溶解氧浓度等恒定的缓冲溶液中，当膜内硫化杆菌的内源呼吸活性一定时，溶液中氧分子通过微生物膜扩散到氧电极的速率就一定．当向待测液中加入含有S2-的溶液，通过扩散进入微生物膜的S2-被膜内硫化杆菌同化而耗氧，使氧分子扩散进入氧电极的速率降低，导致电极输出电流下降．基于此，王晓辉[24]等从酸性土壤和煤粉中分离出选择性较好的氧化硫杆菌菌株固定化成微生物膜，并于氧电极偶联制成硫化物微生物电极．实验证明，在0.03～0.6 mg·L-1和0.42～3.0 mg·L-1范围内，电极响应值与S2-浓度呈现较好的线性关系．该微生物电极具有良好的精密度、稳定性和抗干扰能力，并能应用于实际分析．

2.2 大气环境污染物的监测

2.2.1 用于二氧化硫的监测

图2 生物传感器各步反应示意图Fig.2 Scheme showing the various reactions of the proposed biosensor

此外，一种将噬硫杆菌固定在两片硝化纤维薄膜之间，并与氧电极耦合而制作的生物传感器, 能促使微生物新陈代谢加快，溶解氧浓度下降，氧电极响应改变，从而测出亚硫酸物种的含量[26]．

2.2.2 用于氨的监测

氨气作为一种重要的化工产品与原料，在制药、化肥、医疗、建筑和装修材料加工等行业有着广泛的应用，因此，对氨的监测是环境保护的一项重要指标．现有测定方法所使用的商品氨电极易受挥发性胺或离子的影响，于是有人提出用电化学微生物传感器方法测定氨．

其工作菌株包括硝化单胞菌和硝化杆菌，首先将微生物吸附在多孔醋酸纤维素膜上，然后在贴有微生物膜的氧电极的末端覆盖上一层透气膜，制成测定NH3的微生物传感器．该传感器测量的线性范围为0.1～42 mg·L-1, 相对误差为±4%，整个测量过程只需几分钟[27]．该微生物传感器对氨的测定展现出测量范围广、灵敏度高和响应快的优点．

2.3 农药残留的监测

农药的长期使用所带来的农药残留问题已经成为影响环境安全与人类健康的重大隐患[28-29]，对其毒性和残留时间的研究已经引起了人们广泛关注．尽管传统高效液相色谱、气相色谱和质谱[30-32]在农药含量的检测中给出了令人满意的分析结果，但是新的检测传感器具有更迅速、更便宜，且可以进行现场分析的优点．

对于农药残留监测，乙酰胆碱酯酶类传感器是目前研究较多的一类．有机磷农药由于其较高的杀虫活性而被广泛应用．它可以和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性中心丝氨酸上的羟基结合，抑制AChE的活性，导致AChE失去对乙酰胆碱的水解能力．而乙酰胆碱可以在AChE的催化作用下水解为乙酸和胆碱，胆碱是一类电活性物质可产生特征的循环伏安峰，可以根据胆碱峰电流的变化来监测AChE的抑制程度．例如，孙燕春等[33]用AuNPs/壳聚糖-SiO2杂化的溶胶凝胶将AChE修饰到玻碳电极上．以氯化硫代乙酰胆碱(ATCl)为底物，ATCl在AChE的作用下生成硫代胆碱，硫代胆碱具有电化学活性，能产生1个不可逆的氧化峰．该传感器对硫代胆碱氧化峰的变化值与久效磷浓度的线性范围在0.5～12.0 mg·L-1，检出限为0.02 mg·L-1，表现出良好的重现性和稳定性．

张梅[34]等利用AChE/Nafion/普鲁士蓝修饰的玻碳电极实现了对有机农药西维因和敌百虫的检测，西维因和敌百虫的检出限分别为5.0和10.0 nmol·L-1．对于模拟的实际样品的测定具有较好的重现性、灵敏度和抗干扰能力．刘润等[35]利用戊二醛将AChE和牛血清白蛋白固定到羧基化的纳米管修饰电极表面，构建了一种用于检测有机磷农药的安培型生物传感器，该传感器具有良好的重现性，对辛硫磷及氧化乐果的检出限分别达到3.6×10-4和5.9×10-4g·L-1．孙霞等[36]将功能化多壁碳纳米管(FCNTs)与壳聚糖(CHIT)和戊二醛(GTA)导电聚合物结合形成凝胶溶胶，在玻碳电极(GCE)表面滴涂凝胶溶胶制得FCNTs-CHIT-GTA/GCE电极．该修饰电极与乙酰胆碱酶膜结合，构建一种反应灵敏、快速、稳定、用于检测有机磷农药的电流型生物传感器．其最低检出限为20 ng·L-1，适合检测多种有机磷农药．

此外，相对于酶的禁阻效应的电化学生物传感器，有机磷水解酶(OPH)也是一种被广泛应用于有机磷农药检测的酶．由于OPH能够水解有机磷农药并且释放出H+，而生成的H+与有机磷农药的浓度成比例关系．因此，将OPH与pH电极结合构成电位型OPH传感器．该种传感器能够通过检测反应溶液中H+浓度的变化, 进而确定待测液中有机磷农药的含量[37]．ASHOK等[38]开发了安培型OPH生物传感器用于检测有机磷农药,其检出限远低于电位型传感器．由于OPH水解对氧磷、对硫磷等农药生成具有电活性的对硝基酚(PNP)，因此，通过测定PNP的氧化电流以达到检测有机磷农药含量的目的[39]．ASHOK等[38]用印刷技术制成条形碳糊电极，将含OPH的Nafion溶液滴于其上, 制成的OPH传感器充分发挥了高的生物催化活力, 对氧磷、甲基对硫磷这两种农药的最低检测限分别低达9×10-8和7×10-8mol·L-1．

3 电化学生物传感器的发展趋势与展望

电化学生物传感器已经发展了近40年，但是由于生物活性单元的不稳定性和易变性等缺点，致使电化学生物传感器的稳定性和重现性还较差．然而，电化学生物传感器作为多学科交叉的高科技领域，将会在生物学、信息学、材料学和微电子学的共同发展下，朝着多功能化、微型化、智能化，以及高灵敏度、高稳定性及高寿命的方向发展，并期望达到与其他技术联用的目的．相信在不久的将来，新一代低成本、高灵敏度及高稳定性的电化学生物传感器将在环境监测领域发挥更大的作用．

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