物理预处理改善食品蛋白酶解特性的研究进展*

陈林，吴克刚，柴向华，余林，刘晓丽，陈琰华

(广东工业大学轻工化工学院食品系，广东广州，510006)

蛋白质酶解是利用蛋白水解酶在温和条件下催化蛋白质水解成氨基酸和小肽。酶解反应速度快，条件温和，专一性强，无氨基酸破坏和有害物质产生，无环境污染，故被认为是水解食品蛋白的最佳方法。蛋白质经适度酶解后除了保留甚至提高其生物价外，功能特性明显优于原始蛋白质;利用蛋白质酶解制备生物活性肽更是成为国内外研究的热点。然而由于许多食品蛋白特殊的组成和结构，蛋白分子高度压缩、结构紧密，对蛋白酶的水解作用具有很强的抵抗力。近年来，许多研究都发现在酶解前采用适当的物理预处理，使蛋白变性或改变其组成及结构，可显著地改善许多食品蛋白的酶解敏感性，从而提高水解度(DH)、缩短酶水解时间、提高酶的利用率、并使有效产物的得率大大提高。此外，物理预处理技术具有操作简单、无毒副作用、对营养破坏小等优点，非常适合于在食品工业中应用。因此，物理预处理对食品蛋白酶解特性的影响已越来越受到食品科学领域学者的关注。本文拟对国内外用于促进食品蛋白酶解的物理预处理技术的作用机理、影响因素、应用优缺点等方面的研究进展做一综述。

1 蛋白酶解的物理预处理技术

物理预处理是利用热、微波、声能、高压、机械能等物理作用形式，对蛋白质进行处理从而改变其结构和性质，使更多的酶解位点得以暴露而与蛋白酶作用，从而促进蛋白酶解。事实上，物理预处理与物理改性的原理相同，只是物理预处理的目的是改善蛋白酶解敏感性，而物理改性的目的是改善蛋白功能特性。根据文献报道，目前常用的物理预处理主要有加热、超声波、挤压、超高压和高速剪切。

1.1 加热预处理

酶水解蛋白前进行加热处理是一种常用的预处理方法。加热处理可以破坏氢键、疏水相互作用和范德华力等次级键，通过变性使蛋白质成为松散的结构，原来包埋于内部的酶水解位点被暴露。但是由于蛋白质结构相互差异很大，因此加热变性的效果也随蛋白质的不同而变化。有研究表明许多植物蛋白(如大豆蛋白［1－2］，花生蛋白［3］，大麻蛋白［4］，油菜籽蛋白［5］)在热变性后比原始蛋白更容易被酶水解，因为植物蛋白经过适度热处理后，维系其蛋白空间结构的氢键、疏水相互作用、范德华力等次级键遭到破坏，引起酶解位点暴露，有利于酶的攻击，使植物蛋白的水解更容易进行。如陶红等［1］发现大豆蛋白经过90℃水浴加热10 min，其水解度由未经热处理的12.0%提高到20.3%，这说明适当的加热预处理可以显著提高植物蛋白的酶解敏感性。

但是动物蛋白在热变性后酶解敏感性往往会下降。如Mohr［6］报道了鱼肉蛋白热变性后不利于被酶作用转化成可溶性氮;段振华等［7］研究发现鳙鱼下脚料在酶解前热处理其水解度明显低于不经热处理的样品。这可能是因为动物蛋白(肌球蛋白、肌动蛋白)富含巯基(—SH)，而植物蛋白(如小麦面筋蛋白、玉米蛋白)中硫主要以二硫键(—S—S—)形式存在，所以动物蛋白经热处理后，往往导致—SH破坏(半胱氨酸、胱氨酸间氧化缩合)，形成更稳定的—S—S—键，不利于水解酶的作用，引起蛋白酶解敏感性的降低［8］。此外，无论对哪种蛋白，必须掌握好适当的热处理程度，温度过高或加热时间过长，都会使已变性展开的蛋白分子因疏水相互作用或形成－SS－导致致密的网状结构形成，酶解位点反而被包埋［3－4］。

加热预处理的方式主要有水浴法、水热法和微波加热。水浴法以水为介质，在常压条件下对蛋白进行加热处理。水热法是在密闭的压力容器中(如高压灭菌锅)，以水或其他液体作为介质，在高压条件下对蛋白进行加热处理。在水热法中，由于蛋白质同时经历高温、高压2种作用，因此会发生一些常压加热不会出现的变化。如Radha等［2］在酶解前对商品化大豆分离蛋白分别进行水浴法加热(90℃)和水热法加热(121℃，9.8 MPa)，结果发现水浴法加热预处理对商品化大豆分离蛋白的酶解敏感性没有显著影响;但是水热法加热预处理却有明显的改善效果。原因可能是高温和高压相联合对破坏大豆蛋白中的二硫键具有协同增效作用，因此可使已发生变性聚集的蛋白分子展开［9］。

微波加热利用频率108～1011Hz的电磁波产生交变电磁场，使物料中极性分子产生高速取向运动，相互摩擦，温度急剧升高，从而达到加热的目的。目前已有研究报道了微波加热预处理可以改善大豆蛋白［10－11］、蛾豆蛋白［12］的酶解敏感性。影响微波加热预处理效果的重要因素是微波功率和加热时间。齐莲子等［10］在酶解前采用微波加热对脱脂豆粕进行预处理，结果发现最佳预处理条件是:微波功率420 W，处理时间2 min，该条件下水解度提高了2.0%;如继续增大微波功率或延长加热时间，水解度反而会下降。根据文献报道，微波加热预处理对蛋白质酶解的促进效果与水浴加热接近，但微波加热所需的时间更短［11］。这是因为微波是一种电磁波，对物料具有穿透性，可使物料内部和外部同时受热。因此微波加热与常规加热方式相比，具有加热迅速的优点，对固体和半固体等存在加热温度梯度的食品尤为有效。

1.2 超声波预处理

超声波可分为2类:一类是高频率低振幅超声波(频率范围5～10 MHz)，这种超声波的能量比较小，一般小于1 W/cm2，可用于食品的无损检测，因此也被称为检测超声波。另一类是低频率高振幅超声波(频率范围20～100 kHz)，这种超声波的能量很大，可达10～1000 W/cm2，因此被称为功率超声波。功率超声波在介质传播时具有空化效应，可产生高速微射流、强烈冲击波和局部高温，具有改变物质理化性质和结构的能力。功率超声波是一种用途广泛的新兴食品加工技术，已在食品工业中被用于杀菌、乳化、提取、干燥、加速氧化等。功率超声波有2种处理方式——探头式超声技术和槽式超声技术。探头式超声对液态样品进行处理时，超声探头直接浸入液体，其声强可达数百W/cm2。槽式超声对液态样品进行处理时，反应液可直接装入槽内，但声波经过反射、衰减等损耗，真正作用于反应液的声强较小。在目前的文献报道中，对食品蛋白(如大豆蛋白［11，13－14］、花生蛋白［15］、小麦面筋蛋白［16］、酪蛋白［17］)的酶解预处理多采用探头式超声技术，因为探头式超声比槽式超声的功率密度大［18］。

超声波的功率是影响蛋白酶解敏感性的重要因素。本课题组采用28 kHz超声波对大豆分离蛋白进行预处理，结果发现在超声波功率为400 W时，水解度最大(提高了3.1%);之后随着功率的增大，水解度逐渐下降［13］。这说明预处理时超声波功率也不是越大越好，功率过大可能导致蛋白变性聚集，反而不利于蛋白酶解。除了功率外，超声波的作用效果还受处理时间、样品温度、pH 等的影响［14－17］。有研究表明，超声波可以破坏蛋白分子内或分子间的疏水作用和范德华力，但对氢键和二硫键影响却很小，因此超声波对蛋白分子结构的影响与热效应不同［18］。云田田等［11］比较了加热(水浴、微波)和超声波对大豆粕蛋白酶解敏感性的影响，结果发现超声预处理的效果不如加热预处理。原因可能是超声波对蛋白质的三级和四级结构有破坏作用，但对其二级结构影响较小，因此只能使蛋白部分展开。

1.3 挤压预处理

挤压技术是现代食品加工的高新技术之一，挤压机集加热、加压、剪切、膨化等多种单元于一体，且挤压过程在极短时间内就可完成。在挤压机筒内，蛋白原料在高温(100～200℃)、高压(2～10 MPa)作用下，发生包括共价键、二硫键、肽键和次级键在内的复杂化学反应，使蛋白失去原有结构，物料形成连续的塑性‘熔融体’;在螺杆剪切作用下，‘熔融体’中蛋白分子呈现线性定向排列(纤维状);最后由模头挤出时，物料从高压高热状态突然进入大气常压环境中，挤出物因此释放出大量过热蒸汽，发生膨化作用。从物理特性来说，挤压使蛋白原料转变成膨松和多孔状的结构;从化学观点来说，挤压使原料中的蛋白重新组合成有一定结构的纤维状蛋白体系［19］。

目前国内外已有不少研究报道了挤压预处理对大豆蛋白［19－21］、玉米蛋白［22］、小麦面筋蛋白［23］、芸豆蛋白［24］的酶解敏感性的影响。如 Marsman等［19］发现在双螺杆挤压过程中大豆分离蛋白的结构会发生变性重组，由球状聚集态重组为伸展纤维状，更多的酶切位点因此暴露出来，蛋白的酶解敏感性得以提高。本课题组之前的研究比较了超声、超高压、挤压3种预处理对商品化大豆分离蛋白酶解敏感性的改善效果，结果发现挤压预处理的效果最好［19－20］。这可能是因为挤压预处理对蛋白的改性作用比较强，不仅可以破坏次级键，而且可以破坏二硫键、肽键等共价键，并使蛋白结构发生重组，形成易于酶解的结构。因此对于已经发生变性聚集的商品化大豆分离蛋白，挤压预处理也能显著改善其酶解敏感性。

挤压预处理效果与挤压过程的温度、物料含水量和螺杆转速密切相关。如柴华等［23］研究发现挤压预处理中各因素对小麦面筋蛋白酶解敏感性的影响主次关系为:螺杆转速＞物料含水量＞温度;最优挤压预处理工艺条件是:螺杆转速130 r/min、物料含水量50%、温度145～150℃，小麦面筋蛋白的水解度由未经挤压处理的6.93%提高到15.49%。本课题组发现挤压预处理温度对大豆分离蛋白的酶解敏感性有显著影响;最优处理温度是160℃，大豆分离蛋白的水解度由未经挤压预处理的 4.5%提高到11.3%［20］。可见，适当的挤压预处理对食品蛋白是一种非常有效的酶解预处理技术。

1.4 超高压预处理

超高压(＞100 MPa)可使维系生物高分子立体结构的非共价键破坏，并诱导分子构象进行重排，从而对其结构和性质产生影响。根据处理方式的不同，可分为静高压和动态高压(高压均质)。

据报道，静高压处理对许多食品蛋白(如大豆蛋白［25］、β－乳球蛋白［26－27］、卵清蛋白［28］、鸡蛋清蛋白［29］)的酶解敏感性都有改善作用，且作用效果与处理压力密切相关。如Chicón等［28］发现当静高压预处理的压力达到200 MPa，β－乳球蛋白的水解度才有显著提高;而Jung等［25］发现，当静高压预处理的压力达到500 MPa，大豆粕蛋白的水解度才有显著提高。有研究表明，静高压可以破坏蛋白分子内或分子间的疏水相互作用、范德华力等次级键，但二硫键对静高压不敏感［27，30］。如 Kieffer等［30］研究发现当静高压达到1 000 MPa时，小麦面筋蛋白的二硫键才开始被破坏。因此对含有较多二硫键的食品蛋白(如小麦面筋蛋白、玉米蛋白、鹰嘴豆蛋白等)，静高压预处理的效果可能不显著。如Zhang等［31］发现鹰嘴豆分离蛋白经过静高压预处理(200～600 MPa)后，其水解度没有显著变化。

静高压处理时样品仅仅产生高压诱导的变化，而在高压均质过程中，剧烈的处理条件如高压、强烈剪切、空穴爆炸、高频振荡等机械力的综合作用将导致物料分子结构发生更显著的变化。此外，高压均质可连续操作，是工业化生产的有利条件，因此被认为是食品加工中最有潜力和发展前途的物理改性技术之一。目前已有研究报道了高压均质对食品蛋白酶解敏感性的影响。如Dong等［32］发现高压均质预处理在40 MPa压力下就可显著提高花生蛋白的酶解敏感性。陈剑兵等［33］也发现高压均质预处理对油菜籽蛋白的酶解有促进作用，且随着压力的增大(0～120 MPa)作用效果越明显。

1.5 高速剪切预处理

目前有学者研究了高速剪切预处理对大豆蛋白［10，34］、玉米蛋白［35］的酶解敏感性的影响。如郭维静［35］等发现玉米蛋白粉分散液经高速分散均质机剪切预处理后，底物颗粒粒径显著减小，水解度显著增大。据报道，高速剪切作用可破坏蛋白聚集体和蛋白质分子的高级结构，使原本被包埋的酶解位点暴露出来，有利于酶的攻击，从而促进蛋白的酶水解［10］。

影响高速剪切预处理效果的重要因素是样品黏度、剪切速率和剪切时间。高速剪切预处理通常不适用于黏度较大的蛋白样品，因为样品黏度越大，剪切细化的效果越差［35］。在一定范围内，剪切速率越大、剪切时间越长，底物颗粒的粒径越小，越有利于提高蛋白的酶解敏感性;但是如果剪切速率过高或剪切时间过长，都会使样品温度升高，导致蛋白过度变性，形成不溶性蛋白聚集体，反而不利于酶水解［10］。齐莲子等［34］采用高速组织捣碎机对大豆分离蛋白分散液进行高速剪切预处理，结果发现在最优处理条件下(蛋白浓度100 g/L、剪切速率6 000 r/min、剪切时间4 min)，其水解度提高了2.87%。

2 几种蛋白酶解物理预处理技术的比较

不同物理预处理技术的作用机理和设备不尽相同，因此对蛋白结构的影响也不同，所适用的蛋白原料也不同。如何选择合适的物理预处理技术和处理工艺条件，对于改善食品蛋白的酶解敏感性是十分重要的。从表1可以看出，目前报道的蛋白酶解预处理技术各有利弊，在本文之前的部分也做了较为详细的分析探讨。目前从实际对食品蛋白酶解敏感性的改善效果来看，水热法和螺杆挤压的效果最好。它们对许多食品蛋白的酶解敏感性有明显的改善效果，甚至可以提高已变性聚集蛋白的酶解敏感性。由于商品化蛋白原料大都经过喷雾干燥、高温杀菌等高温热处理，蛋白已发生变性聚集。因此水热法和挤压预处理可用于改善商品化蛋白原料的酶解敏感性，在蛋白酶解工业化生产中有良好的应用前景。但是这2种方法也都还有缺点，需要进一步改进。比如水热法预处理对设备要求高，操作较复杂;而挤压预处理使食品品质和风味发生变化。值得注意的是，这2种技术都集成了几种物理作用相互配合(其中水热法处理中物料同时经历高温、高压2种作用;挤压处理中物料同时经历高温、高压、剪切、膨化)，对蛋白结构有很强的破坏效果，而且还可诱导蛋白重组，形成易于酶解的结构形态。因此合理地将协同增效显著、工序衔接性好、安全便捷的几种物理作用相联合，可以形成可行有效的复合预处理技术。

表1 几种蛋白酶解物理预处理技术的比较Table 1 The comparison of several physical pre-treatment techniques used for protein enzymatic hydrolysis

目前已有学者研究了几种物理预处理作用相联合对食品蛋白酶解敏感性的影响。如Riener等［36］在酶解前采用‘热超声’对牛奶蛋白进行预处理(先将牛奶蛋白粉分散液水浴加热到一定温度，然后在此温度下进行超声波处理)，结果发现在温度72℃、超声波功率400 W，处理10 min，牛奶蛋白的水解度提高了3.2%;如果不加热，水解度只提高了2.1%。乐坚等［37］将高速剪切(3 min)、高压均质(20 MPa)、热处理(90℃，10 min)联合起来对商品化大豆分离蛋白进行预处理，结果发现水解度提高了5.4%。几种物理预处理相联合，对食品蛋白酶解敏感性的改善可能会产生协同增效作用，但同时也增加了成本，加大了操作难度。

3 展望

物理预处理可以改变蛋白分子的高级结构和分子间的聚集状态，使其紧密的结构松散开，暴露出更多的酶解位点，或形成某种易于酶解的形态，从而提高了蛋白的酶解敏感性，因此物理预处理是实现食品蛋白质高效酶解的有效手段。此外，物理预处理无毒副作用，非常适合于在食品工业中应用。目前国内外已有不少物理预处理改善食品蛋白酶解敏感性的报道。许多物理预处理对蛋白质分子结构有明显的影响，但是处理过程中蛋白结构变化以及处理后蛋白结构对其酶解特性的影响国内外研究很少，蛋白结构与其酶解敏感性的相关性研究还不深入，预处理对酶解产物功能特性的影响研究也较少。为了更好地对物理预处理和蛋白酶解加以控制，今后有必要进一步探索物理预处理后蛋白结构变化与酶解敏感性的内在关系。

［1］陶红，梁歧.酶法制备大豆寡肽的研究［J］.大豆科学，2004，23(1):26－29.

［2］Radha C，Prakash V.Structural and functional properties of heat－processed soybean flour:effect of proteolytic modification ［J］.Food Science and Technology International，2009，15(5):453－463.

［3］Gall M L，Guéguen J，Séve B，et al.Effects of grinding and thermal treatments on hydrolysis susceptibility of pea proteins(Pisum sativum L.)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53(8):3 057－3 064.

［4］Yin S W，Tang C H，Cao J S，et al.Effects of limited enzymatic hydrolysis with trypsin on the functional properties of hemp(Cannabis sativa L.)protein isolate ［J］.Food Chemistry，2008，106(3):1 004－1 013.

［5］熊善柏，赵思明，赵山.脱脂油菜饼粕中蛋白质的分步酶水解研究_注III.预处理对蛋白质酶水解速率的影响［J］.中国粮油学报，2002，17(3):27－30.

［6］Mohr V.Enzymes technology in the meat and fish industries［J］.Process Biochemistry，1980，15(2):18－21，32.

［7］段振华，张敏，汤坚，等.酶法水解鳙鱼下脚料及其降苦机理研究［J］.食品工业科技，2003，24(5):19－22.

［8］Nilsang S，Lertsiri S，Suphantharika M，et al.Optimization of enzymatic hydrolysis of fish soluble concentrate by commercial protease ［J］.Journal of Food Engineer，2005，70(4):571－578.

［9］Wang C，Johnson L A.Functional properties of hydrothermally cooked soy protein products［J］.Journal of the A－merican Oil Chemists’Society，2000，78(2):189－195.

［10］齐莲子，迟玉杰.预处理方式对酶修饰大豆分离蛋白水解程度的影响［J］.食品工业科技，2010，31(12):156－159.

［11］云田田，陈敏，杨颖，等.不同预处理方法对制备水解植物蛋白的影响［J］.食品科技，2008(2):121－124.

［12］Negi A，Boora P，Khetarpaul N.Effect of microwave cooking on the starch and protein digestibility of some newly released moth bean(Phaseolus aconitifolius Jacq.)cultivars［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2001，14(5):541－546.

［13］Chen L，Chen J S，Ren J Y，et al.Effects of ultrasound pretreatment on the enzymatic hydrolysis of soy protein isolates and on the emulsifying properties of hydrolysates［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59(6):2600－2609.

［14］石彦国，胡春林，赵嘉盈，等.大豆蛋白酶解前处理方法的比较研究［J］.食品工业科技，2007，28(2):111－113.

［15］许均华，李高阳.花生分离蛋白酶解超声前处理条件的优化［J］.中国油脂，2011，36(12):33－37.

［16］Jia J Q，Ma H L，Zhao W R，et al.The use of ultrasound for enzymatic preparation of ACE－inhibitory peptides from wheat germ protein ［J］.Food Chemistry，2010，119(1):336－342.

［17］朱少娟，施用晖，乐国伟.超声波对胰蛋白酶水解酪蛋白的影响［J］.食品与生物技术学报，2005，24(2):50－54.

［18］Jambrak A R，Lelas V，Mason T J，et al.Physical properties of ultrasound treated soy proteins［J］.Journal of Food Engineer，2009，93(4):386－393.

［19］Marsman G J P，Gruppen H，Mul A J，et al.In vitro accessibility of untreated，toasted and extruded soybean meals for proteases and carbohydrates［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1997，45(10):4 088－4 095.

［20］Chen L，Chen J S，Ren J Y，et al.Modifications of soy protein isolates using combined extrusion pretreatment and controlled enzymatic hydrolysis for improved emulsifying properties［J］.Food Hydrocolloids，2011，25(5):887－897.

［21］陈林.物理预处理－蛋白酶控制水解联合改性对大豆分离蛋白功能特性的影响研究［D］.广州:华南理工大学，2010:27－37.

［22］韩颖.膨化预处理对玉米蛋白酶解特性影响研究［J］.粮食与油脂，2010(8):16－18.

［23］柴华.小麦面筋蛋白挤压预处理酶解特性研究［D］.广州:华南理工大学，2008:40－47.

［24］Alonso R，Aguirre A，Marzo F.Effect of extrusion and traditional processing methods on antinutrients and in vitro digestibility of protein and starch in faba and kidney beans［J］.Food Chemistry，2000，68(2):159－165.

［25］Jung S，Mahfuz A，Maurer D.Structure，protein interactions and in vitro protease accessibility of extruded and pressurized full－fat soybean flakes［J］.Journal of the A－merican Oil Chemists’Society，2009，86(5):475－483.

［26］Chicón R，López－Fandiño R，Quirós A，et al.Changes in chymotrypsin hydrolysis of β－lactoglobulin A induced by high hydrostatic pressure［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54(6):2 333－2 341.

［27］Belloque J，Chicón R，López－Fandiño R.Unfolding and refolding of β－lactoglobulin subjected to high hydrostatic pressure at different pH values and temperatures and its influence on proteolysis［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(13):5 282－5 288.

［28］Quirós A，Chichón R，Recio I，et al.The use of high hydrostatic pressure to promote the proteolysis and release of bioactive peptides from ovalbumin［J］.Food Chemistry.2007，104(4):1 734－1 739.

［29］López－Expósito I，Chicón R，Belloque J，et al.Changes in the ovalbumin proteolysis profile by high pressure and its effect on IgG and IgE binding［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(24):11 809－11 816.

［30］Kieffer R，Schurer F，Koehler P，et al.Effect of hydrostatic pressure and temperature on the chemical and functional properties of wheat gluten:Studies on gluten，gliadin and glutenin ［J］.Journal of Cereal Science，2007，45(3):285－292.

［31］Zhang T，Jiang B，Miao M，et al.Combined effects of high－pressure and enzymatic treatments on the hydrolysis of chickpea protein isolates and antioxidant activity of the hydrolysates［J］.Food Chemistry，2012，135(3):904－912.

［32］Dong X H，Zhao M M，Shi J，et al.Effects of combined high－pressure homogenization and enzymatic treatment on extraction yield，hydrolysis and function properties of peanut proteins［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2011，12(4):478－483.

［33］陈剑兵，陆胜民，郑美瑜，等.高压均质对菜籽蛋白功能性质和酶解效果的影响［J］.中国粮油学报，2011，26(11):79－82.

［34］齐莲子，迟玉杰.高速剪切对大豆分离蛋白限制性酶修饰的影响［J］.食品科学，2010，31(22):11－15.

［35］郭维静，权文吉，陈黎行，等.玉米蛋白粉的剪切乳化处理及酸性蛋白酶的水解研究［J］.食品工业科技，2006，27(10):103－105.

［36］Riener J，Noci F，Cronin D A，et al.The effect of thermosonication of milk on selected physicochemical and microstructural properties of yoghurt gels during fermentation［J］.Food Chemistry，2009，114(3):905－911.

［37］乐坚，黎铭.大豆分离蛋白发酵酸奶的制备研究［J］.食品工业科技，2005，26(1):113－114.