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Egr-1诱骗性寡脱氧核苷酸对大鼠动脉损伤后PCNA和CDK4表达的影响

2013-11-21河北省邯郸市中心医院心内科邯郸056001王泰然宋文奇

陕西医学杂志 2013年4期
关键词:中膜球囊引物

河北省邯郸市中心医院心内科(邯郸056001) 王泰然 马 巍 宋文奇

心血管疾病是目前世界上引起人类死亡的主要疾病之一。其中,冠心病(Coronary artery Disease,CAD)是最重要的因心血管疾病死亡的根本原因。经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)方法在过去的20年中发展得非常迅速,已经成为治疗CAD的重要手段。然而,血管成形术后再狭窄(Restenosis,RS)的出现,仍然是影响其中长期疗效的重要因素。RS的本质特征是血管损伤后,血管中膜平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)向内膜下的迁移、增殖以及产生大量的细胞外基质。近3年来,药物涂层支架的应用,明显降低了术后再狭窄率<1 0%,但涂层支架的使用也存在较大问题:在抑制血管平滑肌细胞增殖的同时也抑制了血管壁的内皮细胞生长,使内皮层愈合延迟,不利于内皮细胞功能的改善[1,2]。

随着分子生物学的发展,基因治疗再狭窄可能是一种很有前景的治疗方法[3]。早期生长反应因子-1(Early growth response factor-1,Egr-1)是一种锌指结构转录因子(Transcription factor,TF),调控着多种增殖相关基因的表达[4,5]。在外源性刺激时Egr-1表达增多,促进细胞增殖和血管内膜增生,导致RS等病理性血管修复反应,抑制其表达能够有效防止VSMC的异常增生,从而达到治疗疾病的目的[6]。人们日渐关注以TF为靶点在核转录水平进行阻断的基因干预治疗方法[7]。其中诱骗寡脱氧核苷酸(Decoy oligodeoxynucleotides,Decoy-ODNs)技术是将与TF靶相结合位点(顺式作用元件)序列相同的人工合成双链寡脱氧核苷酸导入细胞内,竞争性诱骗TF与其结合,使TF所调控的能促进细胞增殖的下游基因表达受抑,从而在转录水平上达到抑制细胞增殖的目的[8]。本实验拟通过观察Egr1Decoy-ODN对球囊损伤后大鼠血管Egr-1增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白依赖激酶(CDK4)表达的影响,来探讨Decoy ODN防治RS的作用机制,为实际应用Decoy-ODN防治RS提供进一步的实验依据。

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物:健康雄性Wistar大白鼠,体质量350~400g,由北京维通利华实验动物中心提供,合格证号SCXK(京)2006-0009。

1.2 主要仪器与试剂:2FFogarty导管(美国Baxter health corporation),倒置显微镜(日本OLYMPU S),手动轮转切片机(德国Lecia RM 2235Lecia),医学图像照相系统(日本Olympus BX51),医学图像分析系统(日本Olympus DP2-BSW),手术器材:剪刀,血管夹,止血钳,手术缝针及缝线,注射器等,小型台式离心机(美国SIGMA1-13),紫外分光光度计(日本UV-3000),实时荧光定量PCR扩增仪:(美国ABI PRISM R7500Fast Real-Time PCR System Applied Biosystems)。转染试剂FuGene6(瑞 士Ro c h e公 司),Egr-1兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司),CDK4兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司),PCNA兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司),Decoy-ODN(大连宝生物工程有限公司),总RT-PCR提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司)RT-PCR逆转录试剂盒(宝生物工程大连有限公司),RT-PCR引物(宝生物工程大连有限公司)。

2 实验方法

2.1 大鼠颈动脉损伤的模型制作:健康雄性Wistar大鼠96只,体重350~400g。10%水合氯醛(300mg/kg)麻醉后,颈正中切开,暴露左颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,用血管夹暂时阻断左颈总动脉和颈内动脉,用2F导管从颈外动脉插入向前推进至主动脉弓,推入生理盐水充盈气囊,沿颈总动脉全长回撤,然后抽瘪气囊。这个过程重复三次,且每次回撤时导管旋转90度。造成左颈总动脉内膜损伤。术后结扎颈外动脉,恢复血流,缝合颈部创口。局部使用青霉素以预防感染,喂食标准饲料,自由饮水。

2.2 分组及处理:96只雄性Wistar大白鼠随机分为4组,每组24只。假手术组:只进行颈动脉结扎,但不插入导管,即不造成动脉内膜损伤。单纯损伤组:球囊拉伤左颈总动脉。SCR组:球囊拉伤左颈总动脉后局部注入200μl含有500μg SCR-ODN、30μl转染试剂FuGene6的1mM MgCl2液。Decoy-ODN+Fu-Gene6治疗组:球囊拉伤左颈总动脉后,应用微量注射器局部释放200μl含有500μg FITC标记的decoy ODN、30μl转染试剂FuGene6的lmM MgCl2溶液,使其在局部作用20min。

2.3 Egr-1诱骗及诱骗对照寡脱氧核苷酸(Decoy-ODNs和Decoy-ODNs SCR)的设计合成:Egr-1的诱骗寡脱氧核苷酸(decoy ODNs)基因序列为:上游5'-TCGCCCTCGCCCCCGCTAAGGG-3',下游3'-AGCGGGGGCGGGGG-CGATTCCC-5'。Egr-1的诱骗对照寡脱氧核苷酸(Decoy ODNs SCR)基因序列为:同诱骗序列类似的错配双链寡脱氧核苷酸,上游5'-AGCCGCACCGGC-CTGCCTCGTC-3',下游3'-TCGGCGTGGCCGGACGGAGCAG-5'。经聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化并冻干保存,在其3'和5'端进行硫代修饰,部分寡核苷酸的5'端用FITC标记,以便于在荧光显微镜下观察转染后基因的分布情况。

2.4 在体Decoy ODN转染:室温下分别将500μg Decoy-ODNs与30μl转染试剂FuGene6充分混合成复合物后溶于170μl的lmm MgCl2液中,在制作血管球囊损伤模型的同时,从颈外动脉将混合液局部注入至损伤的血管节段内。在荧光显微镜下观察转染情况。于转染24h后处死大鼠2只,立即取治疗局部的血管放入液氮罐中,经制成冰冻切片(片厚5μm)后,避光于荧光显微镜下观察。

2.5 血管标本的病理学检查:各组血管用石蜡包埋后,从每段血管的横截面随机切下3张切片(片厚5μm),HE染色,光镜显微镜下观察血管内膜增生情况,并应用计算机图像分析软件进行图象分析,每个标本间隔取3张切片,用计算机图像分析软件测量,计算出内膜面积、中膜面积、管腔面积和内膜与中膜(I/M)的面积比。图像分析由操作熟练但不知情者操作。

2.6 Real time RT-PCR法检测血管壁组织的Egr-1、PCNA和CDK4mRNA表达:采用Trizol一步法提取血管组织总RNA,取各组总RNA3μl逆转录合成cDNA,逆转录反应根据逆转录试剂盒要求的标准进行,反应总体积为20μl,反应条件为37℃15min,85℃5s,4℃7min。以2μg cDNA为模板进行PCR扩增,总反应体系为20μl,2μl 的 cDNA,10μl 的SYBRRPremix Ex TaqTM,0.4μl的引物和7.2μl的超纯水。主要的循环参数如下:1个循环的预变性(95°C 30s),40个循环的退火(95°C 5s)和延伸(60°C 34s)。Egr-1上游引物5'-CCCAAACT- GGAGGAGATGA-3',下游引物5'-GAGGCAGAGGAAGACGATG-3'。PCNA上游引物5'-GGGGTGAAGTTTTCTGCGAG-3',下游引物 5'-CGATCTTGGGA-GCCAAATAATAC-3'。CDK4上 游引物5'-CCAGGACCTACGGACATA-3',下游引物5'-TACAGCCAACACTCCACAT-3'。β-actin上游引物5'-CGTGCGTGA-C ATTAAAGAG-3',下游引物5'-TTGCCGATAGTGATGACCT-3'。β-actin作为每个样品的内参。每个目的基因的CT平均值减去对应模板的内参照基因的CT平均值,得到△CT,根据公式:△CT(样本)=目的组基因CT-对照基因内参CT;△CT(对照)=对照组基因CT-对照基因内参CT;△△CT=△CT(样本)-△CT(对照);因此样本目的基因的相对表达量=2-△△CT[9]。实验重复3次。

2.7 采用Western blot法检测血管壁组织的Egr-1、CDK4和PCNA的蛋白表达:提取各组动脉总蛋白,将含有50μg总蛋白的样品用SDSPAGE分离,并转移到PVDF膜上。脱脂奶粉封闭过夜,用TBS液清洗两遍,然后加入1∶400稀释的一抗(Egr-1、PCNA和CDK4)中室温下孵育2h。辣根过氧化物酶标记一抗,化学发光试剂增强反应。凝胶成像分析系统测定条带的平均积分光密度值,记录结果。以β-actin蛋白表达为内参照,目的蛋白和β-actin条带平均积分光密度比值表示目的蛋白的相对含量。

3 统计学分析 所有的检测数据用均数±标准差表示,使用SPSS13.0软件进行统计分析。用单因素方差分析进行数据分析,组间比较采用LSD法,当P<0.05,结果被认为具有统计学意义。

结 果

1 在体转染效果观察 转染24h后,收集血管标本,然后在470~490nm的荧光显微镜下观察,以确定转染效率。转染Egr-1decoy ODN基因24h后,可见血管内膜和中膜有大量绿色荧光分布,证明转染成功(图1)。

图1 Decoy-ODN转染后24h,可见残存内膜及中膜大量绿色荧光分布(×100)

2 血管病理形态学检测结果 假手术组,血管内膜由一层完整的内皮细胞覆盖,无内膜增生,管腔无狭窄;大鼠颈总动脉拉伤后3d,可见内皮剥脱,无新生内膜增生,管腔无狭窄,说明球囊拉伤动脉模型成功;单纯损伤组和SCR组7d时可见内膜增生,管腔狭窄,14d、2ld时内膜增生更明显,内膜及中膜层有大量的增生细胞,排列紊乱,内弹力板模糊,管腔明显狭窄。Decoy-ODN组与同一时间点单纯损伤组和SCR组相比,内膜增生受到抑制(图2),差异有显著性(P<0.01,见附表)。

图2 I为新生内膜,M为中膜,IEL为内弹力板,黑色线段表示新生内膜厚度。

附表 Egr-1decoy ODN对球囊损伤后新生内膜增生的影响(±s,n=24)

附表 Egr-1decoy ODN对球囊损伤后新生内膜增生的影响(±s,n=24)

注:LA为管腔面积,I为新生内膜面积,M为中膜面积,I/M为内膜面积与中膜面积比值。与同一时间点的injury-only组和SCR组比较★P<0.01,#P<0.01;与同一时间的假手术组、injury-only组和SCR组比较▲P>0.05。面积单位:μm2。

组 别 指标7d 14d 21d Sham LA 0.481±0.030 0.483±0.014 0.485±0.035 I ---M 0.136±0.013 0.128±0.025 0.134±0.017 I/M - - -injury-only LA 0.413±0.007 0.391±0.025 0.300±0.028 I 0.092±0.013 0.123±0.024 0.215±0.020 M 0.137±0.008 0.134±0.011 0.130±0.005 I/M 0.673±0.105 0.919±0.159 1.682±0.126 SCR LA 0.400±0.022 0.385±0.010 0.289±0.012 I 0.101±0.023 0.128±0.012 0.229±0.018 M 0.140±0.015 0.129±0.007 0.133±0.009 I/M 0.709±0.113 0.991±0.009 1.732±0.159 Decoy LA 0.461±0.023# 0.441±0.022# 0.440±0.015#I 0.044±0.007# 0.055±0.016# 0.073±0.016#M 0.134±0.019▲ 0.130±0.023▲ 0.136±0.021▲I/M 0.335±0.048★ 0.427±0.123★ 0.543±0.153★

3 血管壁Egr-1、PNCA和CDK4mRNA表达结果 假手术组大鼠动脉Egr-1、PCNA CDK4mRNA的表达微弱,血管球囊损伤后Egr-1、PCNA和CDK4 mRNA的表达增加,Egr-1的表达高峰在21d,单纯损伤组和SCR组表达分别是假手术组的18.05±1.22倍和18.38±1.57倍,PCNA mRNA的高峰在7d,单纯损伤组和SCR组表达分别是假手术组的6.28±0.64倍和6.58±0.62倍;CDK4mRNA的高峰在7d,单纯损伤组和SCR组表达分别是假手术组的4.92±0.40倍和5.28±0.43倍,经Decoy-ODN治疗后,在各个时间点Egr-1、PCNA和CDK4mRNA的表达明显减少,与单纯损伤组和SCR组比较有显著差异(P<0.001)

图3 Egr-1Decoy-ODN对Egr-1、PCNA和CDK4mRNA的表达的影响。

4 Western blot检测血管壁Egr-1、PCNA和CDK4表达结果 假手术组Egr-1和CDK4蛋白微弱表达,血管球囊损伤后Egr-1和CDK4的表达同其mRNA的表达类似。Egr-1的表达随着时间的延长,表达逐渐增高,在21d,免疫印迹带达到最强;而CDK4免疫印迹带的最强度为7d,Decoy-ODN治疗组,蛋白表达较SCR组和对照组相比显著减弱(图4)。

讨 论

PCI是治疗冠心病的重要手段,然而PCI术后的再狭窄却严重影响其远期疗效[10]。近年来,对其发生机制及防治的研究一直是研究的热点。目前对PCI术后再狭窄的治疗研究已经深入到基因水平。近期的研究发现有多种核TF(包括Egr-1)调控着VSMC增殖相关基因的表达,通过干预这些TF的转录翻译过程能够抑制VSMC增殖,达到抑制球囊损伤后内膜过度增生和RS的目的[11,12]。TF是一类DNA结合蛋白,它与基因启动子中特定序列(即顺式作用元件)相结合而调节下游靶基因的转录表达[13]。

图4 Western blot法检测不同时间点各组血管组织目的蛋白表达变化

Egr-1是一种锌指结构转录因子,在正常血管壁中低水平表达或不表达,而在动脉损伤和其它多种刺激可诱导血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)及内皮细胞表达,诱导VSMC的分裂、增殖和内膜增生[14]。SANTIAGO等[15]利用Egr-1反义核苷酸成功地抑制了动脉损伤后Egr-1在VSMC中的表达及VSMC增殖。这表明Egr-1在VSMC的增殖过程中起重要的调控作用。因此干预Egr-1转录因子基因表达,以抑制VSMC增殖,减轻内膜增生,可能为再狭窄防治策略的制定提供了新的思路和选择。

TF诱骗策略是一种针对TF的在核转录水平的基因沉默治疗方法。TF Decoy-ODNs能竞争性结合活化的TF序列特异识别结构域,快速有效的抑制TF与启动子调控序列的特异性结合,从而抑制下游基因的转录起始[13]。常用的Decoy-ODNs为小分子的双链DNA,与反义ODNs相比有许多优点,如双链结构稳定;分子量小,易于合成;具有特异性的靶向结合位点;能抑制启动子区域内由同一顺式作用元件调控的多个基因等。首先报道的应用诱骗技术调控基因表达的实验是将E2FDecoy-ODNs转导入球囊损伤的大鼠颈动脉,结果显著抑制了球囊损伤后2周内的新生内膜形成。随后有人利用NF-κB Decoy-ODNs也显著减轻了球囊损伤后鼠颈动脉新生内膜的生成。近年来国内有研究证明证实了转染Egr-1Decoy-ODNs能够有效抑制球囊损伤后大鼠颈动脉新生内膜的过度增殖,其作用机制可能为抑制碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor,bFGF)或改善内皮功能。

近年来研究表明,血管平滑肌细胞的增殖和迁移受多种因子(生长因子和炎性因子等)、多条途径调控,且呈网络状分布,而细胞周期可能是调控平滑肌细胞增殖的最终交汇点。G1→S期调控点(即G1/S限制点)是哺乳动物细胞周期调控中的两个主要调控点之一,控制着细胞从G1进入S期,决定了细胞对外界增殖信号的反应(进入有丝分裂,发生凋亡或进入静止期修复损伤DNA)。细胞周期的进展依赖于细胞周期素(Cyclin)、细胞周期依赖性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)以及细胞周期依赖性激酶抑制蛋白(CDK inhibitors,CKIs)的相互作用。CyclinD1作为G1期调控蛋白与CDK4形成的复合物在G1→S期转换中起关键作用。另一项研究报告,转染针对CDK2的反义寡核苷酸至球囊损伤的动脉可以抑制内膜增厚。最近的一项研究证实,应用药物干预调节细胞周期,可以抑制血管平滑肌细胞增殖,从而阻止内膜增生。因此,抑制血管平滑肌细胞周期的进程一直被视为一个控制血管平滑肌细胞增殖的有效策略。

PCNA基因属于与细胞增殖周期相关基因,在细胞的增殖启动过程中起重要作用。PCNA主要在细胞核表达,它作为DNA合成酶δ的辅基,为细胞增殖所必需,细胞分裂时协助DNA引导链和随从链的合成;PCNA可以与CDK和Cyclin结合促进细胞增殖;它是DNA复制和细胞分裂过程中DNA多聚酶最重要的辅助因子。在G1后期开始表达,S期达高峰,G2和M期开始下降,静止期细胞表达很少,其量的变化与DNA合成一致,因此可作为评价细胞增生的一个指标。

本研究结果表明,正常的血管壁Egr-1、PCNA和CDK4微量表达,球囊损伤后,Egr-1、PCNA和CDK4表达上调,经Decoy-ODNs治疗后,各个时间点均较SCR组和对照组明显减轻。表明Decoy-ODN是一种新型的RNA水平上的强效基因灭活因子,通过抑制Egr-1的表达,在某种程度上也抑制了PCNA和CDK4的转录与表达,从而阻断细胞周期进程,来抑制动脉损伤后内膜的增生。

本实验成功地从转录水平抑制了VSMC的增殖和内膜增生,为临床治疗再狭窄提供了实验基础。本研究虽然证明可以减轻血管损伤后内膜增生程度,但未能完全抑制内膜增生,考虑有其他因素参与血管损伤后内膜增生,这有待于进一步研究。

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