应激对裸鼠胰腺癌生长的影响

任风梅，刘珍红，李玉军

（1 青岛市城阳区人民医院病理科，山东 青岛 266019； 2 即墨市中医医院特检科； 3 青岛大学医学院附属医院病理科）

近几年来，尽管恶性肿瘤的治疗取得很大的进展，但对胰腺癌仍缺乏有效治疗手段，病人生存率未见明显提高。大部分病人确诊时往往已有转移，属临床晚期，心理恐惧和躯体疼痛必然导致机体处于应激状态，使体内肾上腺素和去甲肾上腺素水平增高。本实验旨在建立裸鼠胰腺癌束缚应激模型，模拟人类应激状态，通过检测移植瘤组织中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）、细胞增殖相关抗原（Ki－67）、血管内皮生长因子（VEGF）、微血管密度（MVD）和内皮细胞增殖相关抗原（CD105）的表达情况，探讨应激促进裸鼠胰腺癌移植瘤生长的机制，为胰腺癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

取雄性 BALB／C（nu／nu）裸鼠20只，4～6周龄，体质量为15～18 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；人胰腺癌细胞株panc－1由中国协和医院微生物实验室提供。检测所需VEGF抗体、CD105抗体、EMMPRIN抗体、Ki－67抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与处理 以含体积分数0.75乙醇的棉球消毒裸鼠皮肤，将（1～2）×107的人胰腺癌细胞株panc－1单细胞悬液（0.3 mL）接种于裸鼠右肩背部皮下，建立皮下移植瘤模型。随机分为荷瘤＋应激组和单纯荷瘤组。荷瘤＋应激组裸鼠束缚于自制束缚筒中，裸鼠在其中仅为活动受限，束缚筒对躯体及尾部均无压迫，具体的实验方法参照文献［1］。单纯荷瘤组正常喂养，不做处理。

1.2.2 观察指标及检测方法 观察各组裸鼠生长状态，处死前测量体质量并采血，－20℃保存备用。裸鼠处死后分别取出肿瘤瘤体，剥离干净后，以滤纸拭净血污，电子天平称取瘤质量。计算肿瘤体积［2］及肿瘤生长率［3］。采用ELISA法检测裸鼠血清肾上腺素的含量。采用PV－6000法检测裸鼠移植瘤组织中 EMMPRIN、Ki－67、VEGF、MVD 和 CD105的表达。MVD计数参照文献［1］的方法，即于低倍镜下观察CD105染色阳性的血管，选取肿瘤MVD最高区域，然后在高倍镜下（200倍）选取5个不重复视野分别进行计数，求其平均数即作为该标本的MVD值。

1.3 统计学方法

采用PPMS 1.5统计软件［4］进行统计分析，实验结果以±s表示，数据间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 两组裸鼠体质量、移植瘤情况比较

实验前两组裸鼠体质量比较，差异无显著性（P＞0.05），单纯荷瘤组实验后体质量明显大于荷瘤＋应激组，差异有显著性（t＝2.713，P＜0.05）。与单纯荷瘤组裸鼠相比较，荷瘤＋应激组肿瘤体积明显增大（t＝－2.486，P＜0.05）、瘤质量明显增加（t＝－2.685，P＜0.05）。见表1。荷瘤＋应激组肿瘤生长率为51.04%。

表1 慢性束缚应激对裸鼠体质量及移植瘤的影响（±s）

表1 慢性束缚应激对裸鼠体质量及移植瘤的影响（±s）

组 别 n 实验前体质量（m／g） 实验后体质量（m／g） 肿瘤体积（V／mm3） 瘤质量（m／g）单 纯 荷 瘤 组 10 15.76±2.07 21.78±1.40 190.48±160.70 0.96±0.41荷瘤＋应激组 10 15.67±2.22 20.26±1.10 387.87±192.90 1.45±0.42

2.2 血清肾上腺素含量

荷瘤＋应激组、单纯荷瘤组裸鼠血清肾上腺素含量分别为（75.68±23.98）、（52.97±8.76）μg／L，两组比较差异有显著性（t＝－2.812，P＜0.05）。

2.3 免疫组织化学染色检测

荷瘤＋应激组裸鼠移植瘤组织中EMMPRIN、Ki－67和VEGF的阳性表达均明显高于单纯荷瘤组，差异均有显著意义（Z＝－2.636～－2.033，P＜0.05）。荷瘤＋应激组MVD平均值为23.58±2.93，单纯荷瘤组MVD平均值为20.64±1.44，两组比较差异有显著性（t＝－2.846，P＜0.05）。见表2。

表2 两组裸鼠移植瘤组织中EMMPRIN、Ki－67、VEGF的表达（只）

2.4 各指标的相关性

移植瘤组织中VEGF的表达与MVD呈正相关（r＝0.475，P＜0.05）；EMMPRIN 与 VEGF及Ki－67的表达呈正相关（r＝0.702、0.534，P＜0.05）。

3 讨 论

3.1 人胰腺癌荷瘤裸鼠束缚应激模型的建立

本实验在应激过程中不压挤动物，动物可以前后活动并不感到疼痛，仅仅是心理感到限制束缚，因此在很大程度上动物处于心理应激，从而基本控制了生理应激对裸鼠影响。虽然心理应激反应因应激原种类、动物种属、性别、生理状态、应激状态的不同而有所差异，但血清儿茶酚胺和糖皮质激素含量升高被视为应激反应的标志。本文结果显示，荷瘤＋应激组血清肾上腺素含量明显高于单纯荷瘤组，说明人胰腺癌荷瘤裸鼠不良心理应激模型建立成功。

3.2 应激与肿瘤细胞增殖的关系

Ki－67是一种细胞核增殖相关抗原，可反映肿瘤的增殖速度。近来的研究显示，Ki－67在人类乳癌、血液肿瘤等多种恶性肿瘤中均过度表达［5］。本实验荷瘤＋应激组移植瘤组织中Ki－67的阳性表达显著高于单纯荷瘤组，说明束缚应激增强了胰腺癌细胞的增殖活性，促进了肿瘤的生长。原因可能是束缚应激时机体内分泌激素水平发生变化，交感神经和肾上腺释放的儿茶酚胺类物质于肿瘤微环境中，可刺激肿瘤细胞的增殖，可能同时也会提高肿瘤细胞的转移能力和促血管生成能力。

3.3 应激与肿瘤微血管生成的关系

VEGF又称血管通透因子（VPF），与细胞上的相应受体VEGFR结合而发挥作用［6］，具有诱导血管生成及抑制细胞凋亡等多种功能 。CD105可以选择性地表达在处于增殖状态的血管，比常规标记血管的指标如CD34更能说明血管生成的情况。本实验结果显示，荷瘤＋应激组移植瘤组织中VEGF的阳性表达和MVD显著高于单纯荷瘤组，而且移植瘤组织中VEGF的表达与MVD呈明显的正相关。实验结果提示应激可能通过上调移植瘤组织中VEGF的表达，而促进肿瘤微血管的生成。一方面随着肿瘤迅速生长，肿瘤组织内部低氧，由于荷瘤＋应激组裸鼠移植瘤生长较单纯荷瘤组迅速且瘤体积较大，所以移植瘤组织内部低氧更严重一些，低氧诱导因子－1诱导了肿瘤细胞VEGF的表达［7］。另一方面，由于荷瘤＋应激裸鼠体内儿茶酚胺类物质水平升高，其中肾上腺素可以与其受体相结合，从而激活c A MP－蛋白激酶A信号传导通路，诱导肿瘤细胞VEGF的表达。

3.4 应激与肿瘤组织中EMMPRIN的关系

EMMPRIN可作用于邻近的肿瘤细胞以及间质中的成纤维细胞，分泌基质金属蛋白酶（MMPs），降解基底膜，水解肿瘤细胞表面的黏附成分，降低细胞间的黏附性，而有助于癌细胞的迁移［8］。本实验结果显示，荷瘤＋应激组移植瘤组织中EMMPRIN的阳性表达显著高于单纯荷瘤组，提示应激能刺激肿瘤细胞产生分泌EMMPRIN蛋白，导致其活性升高，并导致可溶性的EMMPRIN蛋白的释放，进而又可通过旁分泌途径促进邻近的成纤维细胞产生MMPs和EMMPRIN，形成正反馈的调节机制，促进肿瘤的浸润和转移。

3.5 移植瘤组织中EMMPRIN和Ki－67、VEGF表达的相关性

本文的实验结果显示，裸鼠胰腺癌移植瘤组织中EMMPRIN与Ki－67、VEGF的表达均呈正相关，提示EMMPRIN高表达可以促进肿瘤细胞增殖和血管的生成。EMMPRIN提高肿瘤细胞增殖能力的确切机制目前仍不是很清楚。其可能机制如下：①EMMPRIN诱导成纤维细胞产生的MMPs能够降解细胞外基质，导致潜伏在细胞外空间的生长因子释放，从而促进肿瘤的生长［9－10］；②EMMPRIN 通过增加透明质烷的水平来诱导肿瘤细胞锚着非依赖性生长［11］；③EMMPRIN还可以通过减少促进凋亡蛋白的聚集来保护细胞免于失巢凋亡［12］。

总之，本文研究结果提示，应激状态促进裸鼠胰腺癌细胞生长机制可能是通过激活神经内分泌信号传导通路，上调EMMPRIN和VEGF的表达，诱导肿瘤细胞增殖和血管生成而实现的。本实验结果为胰腺癌的治疗提供了新的思路。

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