重组酵母乙肝疫苗体外效力测定方法

康晓冬 马小明

（宁夏农林科学院草畜工程技术研究中心，宁夏银川 750002）

1 材料和方法

1.1 试剂

1.1.1 2 mol/L磷酸盐缓冲液 （含0.15 mol/L氯化钠，pH7.2）称取氯化钠8.850 g，二水磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.226 g和十二水磷酸氢二钠（NaH2PO4·12H2O）1.698 g溶于适量水中，调pH至7.2，加水至1 000 ml。

1.1.2 供试品处理液 量取20%二乙醇胺0.25 ml和10% Triton X-100 0.20ml，加pH7.2PBS至10 ml。

1.1.3 20%二乙醇胺储备液 量取二乙醇胺DEA（在室温下该品可能会边厚或者结晶使用前可加热到30℃以液化）2 ml。加pH7.2PBS至10 ml。置于棕色瓶中室温保存，室温暗处可保存4个月。供试品稀释液取牛血清白蛋白10.0 g，加磷酸盐缓冲液使溶解成1 000 ml，即得。

1.1.4 10% Triton X-100储备液 量取1ml10% Triton X-100加PH7.2PBS至10 ml。室温可保存4个月。如果该溶混浊请勿使用。

1.1.5 1%硫柳汞溶液 称取硫柳汞1g，加pH7.2PBS至100ml，溶解即。

1.1.6 样品稀释液 1%BSA，0.01%硫柳汞溶液，用PBS溶解。

1L的配制方法：取BSA10.0 g置于烧杯中，加pH7.2PBS溶液，约800 ml。磁力搅拌溶解。加1%硫柳汞溶液10.0 ml，再用pH7.2PBS溶解定容至1 000 ml。分装成合适的体积于2℃～8℃暗处保存，有效期1个月。

1.1.7 参考品溶液及供试品溶液的配制 分别精密量取参考品及供试品0.1 ml，加入0.1 ml 供试品处理液，加盖混匀，在20℃～28℃静置30～35 min。将处理后的参考品和供试品以供试品稀释液进行适当稀释，稀释后取1：2 000、1：4 000、1：8 000、1：16 000、1：32 000倍及其他适宜稀释度的参考品和供试品，每个稀释度作双份测定。阴性对照为供试品稀释液（双份），阴性和阳性对照不需稀释。

1.2 实验方法

采用单克隆抗─HBS包被反应板，加入待测标本，同时，加入多克隆抗-HBS-HRP，当标记中存在HBSAg时，该HBSAg与包被抗-HBS结合并与抗-HBS-HRP结合形成抗-HBS-HBSAg-HRP复合物，加入TMB产生显色底物，反之，则无显色底物生成。该检测与标准品做对比，定量检测HBSAg 铝佐剂疫苗的量，在进行检测前将疫苗样品和标准品与二乙醇胺和Triton X―100溶液孵育，目的以减少抗原聚集和提高“AUSIY ME”ELISA法检测样品的可行性。通过对样品和标准品的吸光值的分析，可检测样品的相对效力值。

1.3 实验仪器

酶标仪（SUNRISE 双波长）

2 检测程序

2.1 样品处理试剂盒要放培养箱（37℃）前0.5h（三批样品）。

2.2 所有样品均应在2℃～8℃保存。处理前将参考品溶液和样品溶液在旋涡混合器混合10s左右。

2.3 用前摇动处理液的瓶子以混合均匀。

2.4 分别吸取0.1 ml参考品和样品加到EP管中，然后每管加0.1 ml处理液。加盖，旋涡混合10s，20℃～28℃静置30～35min。

2.5 样品稀释

将处理过后的参考品和供试品分别以样品稀释液进行稀释，如下表1：

表1

2.6 测定顺序

（1）每孔加待测标本50微升，设印行对照，阳性对照各2孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各2滴，设空白对照2孔。

（2）每孔加入酶结合物1滴（空白对照除外），充分混匀，封板，置37℃孵育30 min。

（3）手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔。静置58s，甩干，重复5次拍干。

（4）每孔加入显色剂A液、B液各一滴，充分混匀，封板，置37℃孵育15 min。

（5）每孔加入终止液各1滴，混匀。

（6）用酶标仪读数，取波长450 nm，630 nm，先用空白孔较零，然后读取各孔OD值。

2.7 结果计算

（1）计算阴性对照的平均吸光值（NCX），必须落在－0.06～0.1范围内。如果某个数值落在这个范围之外，则将这个数值重新计算平均值；如果两个数值落在此范围之外，则应作检测；如果更多的数值落在范围之外，则应对其中的技术问题进行修正。

（2）计算阳性对照平均吸光值排除PCX。

（3）计算阳性对照－阴性对照（PCX －NCX），PCX －NCX应≥0.400值。否则应检查技术问题或试剂是否变质，重新进行试验。

（4）每个稀释液对照稀释度应当在0～0.02范围内。

2.8 相对效力计算

2.8.1 列出每次测得的参考品和待检样品的每个稀释度比例的所有吸光值。

2.8.2 从3个检测数据中，用平行线性回归分析法计算每次的相对效力。

2.8.3 三次相对效力的几何平均值即为其体外效力。

2.9 检测结果

以冻干品为标准品，三次相对效力几何平均值应≥0.5。结果判为合格。

3 讨论

由于疫苗制品的检定一般多采用生物学方法测定，因此在检定中就难免出现检定结果准确性不佳，究其原因不外乎有实验动物的个体差异性，所用试剂和原材料的纯度或敏感性不一致等。因此必须对现有检定方法进行标准化和可信性研究。同时必须采用新技术，建立新的准确简便的检定方法，提高疫苗制品的检定工作质量。而质量检定人员也应本着对人民极端负责的精神，严格按照《生物制品规程》要求，对制品进行科学检定。此外还应意识到，疫苗制品的质量是生产出来的，检定只是客观反映制品的质量问题，从而促进质量的提高，而只有对生产过程实施全面的质量管理才能全面有效地保证疫苗的质量水品，生产好的疫苗制品，造福人类。因此在重组（酵母）乙肝疫苗体外效力的检测中一定要认真负责，同时也应该注意以下几点问题：

（1）待检测样品溶液中不应存在与标记酶相同的酶、底物、酶抑制剂和其他干扰因素，以防止干扰作用。

（2）吸附的效果与包被缓冲液的浓度、pH、温育时间有关，还与载体表面积性质有关。包被蛋白质时缓冲液宜偏碱性，离子强度较低，这有利于蛋白质的吸附，包被缓冲液（pH＜6＝时非特异性吸附增加，实验中包被时常采用50mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液，聚苯乙烯塑料表面能吸附转移多的蛋白质，常用浓度1～10μg/ml的免疫球蛋白。浓度过高，蛋白质间的相互作用防碍了蛋白质与聚苯乙烯载体的吸附，不仅浪费试剂，还会降低检测的灵敏度。包被物质必须是可容的，最适浓度可通过棋盘滴定法加以确定。

（3）聚苯乙烯酶标记板测定时，溶液宜垂直滴入凹孔中间，相继加入的溶液都覆盖相同的载体表面积。在吸附温育和洗涤等操作中应避免剧烈振荡，搅拌等，以保证恒定的吸附容量。在洗涤操作中，由于聚苯乙烯反应板凹孔容量小，孔间距离近，故洗涤时要注意每次加入的洗涤液量既要达到洗涤充分又要避免相邻孔内液体互相污染。

（4）在ELISA中血清阴性对照的显色反应常常是酶结合物与固相之间的非特异性吸附所致。在酶结合物稀释时加去污剂（TWEEN）或BSA。

重组（酵母）乙肝疫苗体外效力的测定对评价疫苗的价值具有十分重要的意义。

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