铸造钴铬合金含银抗菌涂层对L929细胞增殖及凋亡的影响*

梁锐英，赵 悦，徐艳丽，吴文慧﹟，孟 贺，赵 敏

1)河北联合大学口腔医学院口腔修复科 唐山 063000 2)清河县人民医院口腔科 邢台 054800

钴铬合金以其生物性能和抗腐蚀性能良好、强度和硬度高、延伸率低、耐磨性好等特点成为临床义齿修复应用的主要材料。钴铬合金铸造支架是活动义齿修复的重要组成部分，也是口腔内链球菌、乳杆菌、放线菌等多种条件致病菌容易沉积的位置。随着义齿戴用时间的延长，基牙患龋率以及义齿性口炎的发生率逐渐升高，采用药物浸泡消毒解决这些问题，存在抗菌广谱、容易产生细菌耐药性及其他副作用等固有的局限性。银系无机抗菌剂具有很好的生物安全性，是目前口腔科临床材料改性中比较理想的抗菌材料，克服了传统有机抗菌剂抗菌谱广、易产生耐药性等缺点。作者采用等离子喷涂方式制备了钴铬合金含银抗菌涂层试件, 其具有良好的抗菌性能，但涂银是否对钴铬合金的生物相容性产生影响并不清楚。该研究中，作者制备了钴铬合金含银抗菌涂层试件浸提液，检测其对小鼠成纤维细胞L929细胞增殖和凋亡的影响，初步评价钴铬合金含银抗菌涂层的生物学性能。

1 材料与方法

1.1试件制作与分组精密铸造的规格为15 mm×15 mm×2 mm的正方形钴铬合金试件(德国BEGO公司)20个，利用万能工具磨床将所有试件切割成10 mm×10 mm×1 mm。其中10个试件表面应用等离子喷涂的方法制作含银抗菌涂层，所用喷涂材料为银粉和铬粉，由北京矿业研究院提供，质量分数分别为3%和97%；剩余10个试件不做任何处理，作为对照。试件表面抛光后，经无水乙醇超声洗涤15 min，去离子水洗3次，烘干，121 ℃高压灭菌后待用。

1.2浸提液的制备无菌条件下将2组试件置于24孔板中，以含体积分数10%小牛血清的RPMI 1640培养液为浸提介质，参考GB/T 16886.12-2005(医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品)，按试件表面积与浸提液体积比为1.25 cm2/mL，于37 ℃、体积分数5%CO2、95%湿度的培养箱(日本Sanyo)中浸提24 h，浸提液经0.22 μm滤膜过滤除菌后待用。

1.3浸提液对L929细胞毒性的测定用2.5 g/L胰蛋白酶(美国Gibco公司)消化对数生长期的L929细胞(天津塞尔生物技术有限公司)，配置细胞悬液，将悬液加入96孔板，并排接种6组，每组5孔，置于孵箱中孵育24 h后,弃去旧培养液，分别加入新鲜培养液(阴性对照组)，体积分数100%、75%、50%、25%含银抗菌涂层试件浸提液(含银浸提液)和对照试件浸提液(对照浸提液)，每孔200 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO2、95%湿度的培养箱中分别孵育24、48和72 h。然后MTT法检测细胞增殖情况，用酶标仪(美国BIO-RAD)在490 nm波长下测定各孔吸光度值，以生理盐水孔作空白对照，计算细胞相对增殖率，参考GB/T 16886.5-2003(医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验)，按相对增殖率评定材料毒性级别[1]。

1.4浸提液对L929细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响取对数生长期的L929细胞，胰蛋白酶消化后，用RPMI 1640培养液配成密度约为6.0×104mL-1的细胞悬液。将1 mL细胞悬液加入已有盖玻片的6孔板中，每组6个复孔，放入37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养24 h，使细胞贴壁生长。倒掉原培养液，实验分3组处理，分别加入含银浸提液原液、对照浸提液原液和RPMI 1640培养液(阴性对照)1 mL，在37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养48 h后，弃上清液，多聚甲醛室温固定40 min，取出细胞爬片，中性树胶粘于载玻片上， 37 ℃山羊血清封闭20 min。每张玻片滴加按100倍稀释的一抗(鼠抗兔Bcl-2或Bax单克隆抗体)，阴性对照用PBS代替一抗，按说明书操作，进行免疫细胞化学染色。采用Image pro plus 6.0医学图像分析系统对蛋白表达强度进行半定量分析。每张玻片选取5个高倍视野，测定每个视野下阳性区光密度值(IOD)，取平均值，表示蛋白表达水平。

1.5统计学处理应用SPSS 17.0进行统计分析。采用单因素方差分析对各组吸光度值、Bcl-2和Bax表达水平及Bcl-2/Bax进行比较，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1细胞毒性测定结果各组吸光度值见表1。不同浓度的浸提液对L929细胞的毒性均为0～1级。

表1 各组吸光度值的比较

2.2各组细胞Bcl-2和Bax蛋白表达水平的比较

见表2。含银浸提液组细胞Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax蛋白表达水平与对照浸提液组比较，差异均无统计学意义，但2组各指标均高于阴性对照组。

表2 各组细胞Bcl-2、Bax蛋白表达水平及Bcl-2/Bax的比较

*:与阴性对照组比较，P<0.05。

3 讨论

细胞毒性试验是通过细胞培养技术测定生物材料或其浸提液对细胞的毒性作用,包括溶解(细胞死亡)、抑制细胞生长和其他毒性等。它在评价材料生物相容性方面的地位已得到证实[2]。细胞毒性试验作为一种初级快速的毒性筛选和生物安全性评价方法，在口腔科领域具有十分重要的地位[3]。

张敏等[4]对涂银羟基磷灰石种植体的细胞毒性进行了评价，发现其具有良好的生物活性。朱辉等[5]证实载银羟基磷灰石人工骨具有良好的生物相容性及安全性。Ando等[6]实验发现含银磷酸钙涂层具有高抗菌活性、低毒性，并且能抑制细菌黏附的优良特性。该实验结果显示，不同浓度含银抗菌涂层的钴铬合金试件浸提液对L929细胞的毒级均为0～1级，有极轻微细胞毒性，与钴铬合金试件浸提液及阴性对照的毒性相当。

生物材料诱导细胞凋亡的信号途径主要包括膜死亡受体信号途径、线粒体途径和其他参与凋亡信号调控的传导系统[7]。其中，Bcl-2和Bax在线粒体途径中起着非常重要的调控作用。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促进凋亡因子[8-9]。Bcl-2蛋白能够阻遏细胞凋亡，延长细胞的寿命，参与调控细胞增殖与凋亡的动态平衡，同细胞分化、成熟、组织器官的发育及肿瘤的发生关系密切。研究[10]发现，烤瓷合金在龈沟液内腐蚀析出的金属离子及其衍生物可引起机体组织的毒性反应，并可引起细胞凋亡。Bax与Bcl-2形成异二聚体复合物，可促进细胞凋亡，其比值对细胞是否发生凋亡起决定性作用。 Bcl-2/Bax比值越高，细胞的生存率越高；比值越低，细胞的生存率越低[11]。该实验结果表明，用含银抗菌涂层钴铬合金试件浸提液处理后，L929细胞Bcl-2/Bax比值与对照试件浸提液接近，提示钴铬合金含银抗菌涂层对细胞凋亡的作用与钴铬合金接近。

总之，作者应用MTT法在细胞水平上评价了钴铬合金含银抗菌涂层的细胞毒性，应用免疫细胞化学染色法从分子水平上观察了钴铬合金含银抗菌涂层对细胞Bcl-2和Bax表达的影响，从分子水平上证实了该涂层的生物毒性较小，生物相容性较好。但对这种涂层材料生物相容性的全面评价仍需结合其他实验进行更深入的研究与探讨。

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