老年人缓慢窦性心律患者Klotho水平测定的临床意义

苏显明，杨 伟，何亚军，王小芹，段 静，张 玮，马 奕

(1西安交通大学医学院第一附属医院老年心血管内科， 西安 710061;2陕西省核工业215医院心内科)

随着人体衰老，心脏传导系统也同人体其他器官一样，发生退行性改变。窦房结作为维持人体心脏跳动的最高起搏点，也会随着年龄的增长，由于各种原因的影响，发放冲动的次数渐渐减少，在临床上表现为窦性心动过缓、窦性停搏等改变。最近的研究发现血浆 Klotho蛋白和机体的衰老有关［1］，klotho基因在心脏表达仅限于窦房结，对窦房结具有保护作用［2，3］。本研究对75岁以上老年缓慢窦性心律患者进行血浆Klotho蛋白水平检测，以探讨高龄老年人缓慢窦性心律与血浆Klotho蛋白之间的关系。

1 资料及方法

1.1 临床资料

随机选择2009－07～2011－06先后西安交通大学医学院第一附属医院老年心血管内科收治的75岁以上不重复住院患者225例，征得患者及家属同意，对入院时心电图提示为窦性心动过缓(心室率≤55次/min)116例(排除服用心率减慢药物的患者12例，剩余104例构成实验组)，心电图正常患者109例作为对照组;对实验组及对照组患者均进行动态心电图(Holter)监测。实验组患者年龄75－95岁，平均(77.17±2.21)岁，男性 72例，女性 32例。其中高血压病43例，冠心病40例，其他(如单纯心律失常等)21例。对照组患者年龄75－95岁，平均(76.36±2.41)岁，男性76例，女性33例。其中高血压病46例，冠心病44例，其他19例。所有入选患者入院时均经过询问病史、体格检查、X线检查、心电图、超声心动图以及相关实验室检查等，排除了急慢性肝、肾疾病、肿瘤、脑血管病、周围血管性疾病等。

1.2 方法

1.2.1 动态心电图监测 采用中健公司BIOX－200型动态心电图记录和分析仪，MV5及MV1导联，每例均连续记录24 h。自动分析与专人核对每份记录结果。对并存各种早搏、房颤等心律失常均以基础心律记录之。将104例患者按动态心电图结果分为三个亚组:窦性心动过缓组、窦性停搏组及房室传导阻滞组。当窦性心动过缓、窦性停搏及房室传导阻滞同时出现在同一份记录中时记入窦性停搏组;窦性心动过缓与房室传导阻滞同时出现在同一份记录中时记入房室传导阻滞组。

1.2.2 采血与血浆Klotho蛋白检测 实验组与对照组患者，采晨起空腹肘静脉血3－5 mL后于2 000 r/min离心10 min，吸取上清液封口后于－80℃冰箱保存待测。检测时将患者血清按1∶10稀释后加入96孔板中，每孔0.1 ml，4℃过夜;次日弃去孔内液体，用含有吐温－20 PBS洗涤液清洗5次;加入英国abcam公司提供的抗血浆 Klotho蛋白抗体(ab76356)。klotho抗体用含牛血清白蛋白PBS稀释，稀释比例1∶12 500，稀释后加入96孔板中，每孔0.1 ml置入37℃温箱孵育1 h;弃去液体，用含有吐温－20的PBS洗涤液清洗5次;加入辣根酶标记的山羊抗兔抗体，用含牛血清白蛋白PBS稀释，稀释比例1∶2 000，稀释后加入96孔板中，每孔0.1 ml置入37℃温箱孵育1 h;弃去液体，用含有吐温－20 PBS洗涤液清洗5次;加入新鲜配制成的TBM显色剂每孔0.1 ml置入37℃温箱孵育30 min，终止液终止反应。于美国产酶标仪(型号550)中测读。所有值至少重复检测2次。

1.2.3 病例分组 根据动态心电图检查结果，将104例窦性心动过缓患者分为:窦性心动过缓组43例，窦性停搏组36例，房室传导阻滞组25例(其中Ⅰ度19例、Ⅱ度以上16例)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 患者基础情况比较

两组患者性别构成、年龄、合并疾病(高血压、冠心病及其他疾病)以及肝肾功能、血脂、血糖之间差异无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

表1 两组患者一般资料比较Tab 1 Comparison of baseline between experiment group and control gruop

2.2 高龄老年缓慢性窦性心律患者klotho水平比较

104 例高龄老年缓慢性窦性心律患者血浆Klotho蛋白吸光度明显降低，与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。窦性停搏组患者血浆Klotho蛋白吸光度均低于窦性心动过缓组及房室传导阻滞组，差异有统计学意义(P＜0.05);而窦性心动过缓组与房室传导阻滞组患者血浆Klotho蛋白吸光度比较，差异无统计学意义(P＞0.05，见表2)。

表2 实验组与对照组klotho水平比较Tab 2 Comparison of klotho protein expression between experiment group and control group

2.3 窦性停搏发生次数与klotho水平相关性

36例窦性停搏患者按24 h停搏发生次数与血浆Klotho蛋白吸光度进行Pearson相关性检验，结果显示klotho吸光度随停搏次数增加而降低，两者存在负相关(r=－0.888 4，P＜0.05，见图1)。

图1 窦性停博次数与血浆klotho水平之间的相关关系Fig 1 The correlation between total times of sinus arrest and the level of plasma Klotho protein

3 讨论

随着年龄的增长，窦房结的功能因疾病及退行性改变而减低，这是老年人发生心律失常的重要原因之一。窦性心动过缓多见于老年人群，本资料中入院时发现窦性心动过缓病例(除应用影响心率减慢治疗者外)占所有病人数的46.22%(104/225)。这可能与患者高龄、窦房结退变加重导致心室率减慢有关。

klotho基因是Kruo等［1］在1997年研究自发性高血压时发现的与衰老有关的新基因，该基因定位于染色体13q12区域［4，5］，由5个外显子和4个内含子组成，全长50 kb。人、小鼠、大鼠的klotho cDNA长度约为5.2 kb，外显子总长分别为3 022，3 036，3 042 bp。人、小鼠、大鼠 klotho之间有同源性，人和小鼠间有80%的同源性，人和大鼠间有83%的同源性。研究表明，klotho基因mRNA外显子有一内在剪切位点，如果这一位点接受50 bp片段插入，其RNA就表达3个外显子，从而编码分泌型蛋白，其分泌型蛋白大约549个氨基酸［6］。近年来，从基因结构、基因的表达、蛋白产物及其功能等各个方面，大量学者进行了许多深入的研究，然而有关klotho的心血管功能方面研究一直是研究的难点，2003年Takeshita等［3］研究发现，klotho对窦房结具有保护作用，但其确切的作用机制至今仍未阐明。

本研究测定老年人血浆Klotho蛋白吸光度，窦性心动过缓组患者血浆Klotho蛋白吸光度较对照组低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，窦性停搏组患者血浆Klotho蛋白吸光度也分别低于窦性心动过缓组及房室传导阻滞组，差异有统计学意义(P＜0.05)。进一步分析发现，患者klotho吸光度随停搏次数增加而降低，两者存在负性关系(r=－0.888 4，P＜0.05)。说明血浆Klotho蛋白对维持窦房结正常起搏功能起着非常重要的作用，随着人体逐渐衰老，血浆Klotho蛋白含量减少，致使窦房结因失去正常保护而功能减低，这可能是老年患者易发生缓慢窦性心律失常的重要原因之一。

本研究结果提示，对缓慢窦性心律失常尤其是窦性停搏患者，血浆Klotho蛋白水平在一定程度上可以反映窦房结起搏功能状态，可以作为评价窦房结功能的指标之一。由于研究资料有限，血浆Klotho蛋白如何保护窦房结正常功能的机制目前仍不清楚，仍需要大量基础及临床研究加以阐明。

［1］Kuro M，Matsumura Y，Aizawa H，etal.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling aging ［J］.Nature，1997，390:45－51.

［2］Opthof T.Function and structure of the mouse sinus node:nothing you can see that isn’t shown ［J］.Cardiovasc Res，2001，52(1):1－4.

［3］Takeshita K，Fujimori T，Kurotaki Y，etal.Sinoatrial node dysfunction and early unexpected death of mice with a defect of klotho gene expression［J］.Circulation，2004，109(8):1776－1782.

［4］Shiraki-Iidat，Aizawa H，Matsumura Y，etal.Structure of the mouse klotho gene and its two transcripts encoding membrane and secreted protein［J］.FEBSLett，1998，424(1－2):6－10.

［5］Saito Y，Kuro-Om，Nabeshima Y，etal.The protective roleof klotho gene on vascular endothelium ［J］.Nippon Rinsho，1999，57(7):1514－1518.

［6］Imura A，Aiwano A，Tohyama O，etal.Secreted Klotho protein in sera and CSF:implication for post-translational cleavage in release of Klotho protein from cell membrane［J］.FEBSLett，2004，565(1):143－147.