BALB/c小鼠神经母细胞瘤移植模型的建立及相关影响因素的研究

张锐虎，荣 曼，刘田福

(山西医科大学实验动物中心， 太原 030001;*通讯作者，E-mail:YKDLTF@yahoo.com)

神经母细胞瘤是一种儿童常见的实质性肿瘤，大约65%的肿瘤起源于腹部，15%－20%起源于胸部，其余15%起源于颈部、骨盆等。该病中位发病年龄为22个月，早期难发现，易误诊误治［1］。本实验通过给不同年龄、不同部位的BALB/c小鼠接种神经母细胞瘤(N2a)细胞，成功建立了神经母细胞瘤动物移植模型，为神经母细胞瘤的研究提供了理想的实验材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与细胞 清洁级BALB/c小鼠，由山西医科大学实验动物中心提供;N2a细胞株，购于中科院上海生命科学院细胞资源中心。

1.1.2 试剂及仪器 DMEM/F－12培养液、胎牛血清、青霉素、链霉素、PBS、0.25%胰蛋白酶消化液;超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱、75 cm2培养瓶、移液管、吸耳球、酒精灯等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 N2a细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/ml链霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培养液中，在37℃、饱和湿度的5%CO2孵箱中培养。传代时吸尽培养液，加入1－2 ml PBS清洗残留的培养液，吸弃后加入0.25%胰蛋白酶消化液1－3 ml，均匀铺满培养瓶底部。置培养箱中2－5 min，镜下见细胞收缩变圆或少数悬浮时，轻轻拍打培养瓶侧面使细胞全部悬浮。加入刚吸出的旧培养液终止消化。移入离心管，1 000 r/min离心5 min，弃掉培养液，加入2－3 ml新培养液，将离心产生的沉淀轻轻吹打成细胞悬液。按1∶2－1∶3的比例分置到培养瓶内，加入完全培养液后继续培养［2］。

1.2.2 注射用细胞悬液的制备 选择对数生长期细胞，经消化、吹打、加培养液等制成单细胞悬液。在计数板上盖玻片的一侧滴加微量(约100μl)细胞悬液，使细胞悬液充满计数板和盖玻片之间的空隙。显微镜下计数活细胞，根据公式:浓度=(4个大格的细胞总数/4)×104个/ml，计算细胞悬液的浓度，并通过加减培养液将细胞浓度调整为1×107个/ml［3］。

1.2.3 实验动物的准备及分组 BALB/c小鼠饲养于屏障环境，温度22－25℃，相对湿度50%－70%。饲料、垫料经120℃高压消毒20 min，自由采食与饮水，垫料每周更换2次［4］。实验鼠按出生顺序以窝为单位随机分为腹腔、颈背、腋下3个注射组，首次注射在1－7 d进行，根据外观和触摸检查对确定未长瘤的鼠只在8－14 d进行再次注射;并对仍确定未长瘤者在15－21 d时进行了第3次注射。

1.2.4 细胞接种 1－3 d鼠的接种量为0.1 ml/只，剩余年龄段的均为0.2 ml/只。注射时根据注射部位，选择相应的体位进行抱定。其中进行腹腔和腋下注射时，选择迎面抱定;进行颈背部注射时，取俯卧位固定，用食指和拇指轻轻提起颈背部的皮肤，在形成的三角区进行注射。70%酒精消毒注射部位，1 ml注射器抽取细胞悬液，轻柔进针，缓慢注射，待注入大半时，边退针边注射。完成后，停留片刻再缓慢拔针，以防注射液外漏［1，5］。

1.2.5 模型鉴定 接种细胞后次日即开始观察并触摸小鼠的接种部位，当发现有鼓胀或触摸有异物感时，即可初步判断有瘤组织生成，继续进行观察，若发现瘤体逐渐增大即可基本确定，潜伏期按接种之日到初步确认的日期计算［1，6，7］。

1.2.6 实验鼠生长曲线的测定 实验鼠自细胞接种之日起，每周称量一次体重。

2 结果

2.1 动物数量及存活率

此次共有12窝、53只BALB/c小鼠参与实验。50只完成实验的BALB/c小鼠中有雌鼠19只、雄鼠31只，总的存活率为94.34%。21只荷瘤鼠占完成实验鼠的比例为42%，其中有雌鼠11只、雄鼠10只，各性别实验鼠的成瘤率为57.89%、32.26%，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 不同注射部位成瘤率的比较

从成瘤率来看，腹腔注射的成瘤率最高，达到了46.15%(见表1)。

表1 不同接种部位成瘤率的比较Tab 1 Comparison of tumor formation rate among different inoculation sites

2.3 不同接种日龄对成瘤率的影响

在三个年龄段中1－7 d的成瘤率最高，达48.39%。随着年龄的增长，鼠只越容易抱定和注射，发生外溢的现象也随之减少，但成瘤率却未见增长(见表2)。

表2 不同年龄接种成功率的比较Tab 2 Comparison of tumor formation rate among different ages

2.4 移植瘤的潜伏期

本实验中潜伏期最短的为5 d，最长的有31 d，最多的在11－15 d，占荷瘤鼠的比例为61.9%(见表3)。

2.5 荷瘤雌鼠与正常雌鼠生长曲线的比较

实验中随机选取了10只未参与实验的同龄雌鼠与荷瘤雌鼠一起每周称重一次，分别绘制生长曲线。通过对各时间点体重及生长曲线的分析，发现两组鼠只在0－3周和7－8周这两个时间段的体重比较吻合，两者间差异无统计学意义上，而在4－6周及9周以后两组间的差异有统计学意义。由图1可知，从出生到3周，荷瘤鼠与正常鼠的生长曲线基本吻合，说明注射细胞后，由于潜伏期的存在，对荷瘤鼠的体重增长基本无影响。4－5周荷瘤鼠的体重增长明显慢于正常鼠，6周体重增长加速，在7－8周接近正常鼠的水平，此后仍以较高的速度增长，并超过正常鼠(见图1、表4)。

表3 荷瘤鼠的潜伏期分布情况Tab 3 The distribution of incubation period of tumorbearing mice at different incubaton period

图1 正常鼠与荷瘤鼠的生长曲线Fig 1 Growth curve of normal mice and tumor－bearing mice

表4 各组在不同时间点体重的变化Tab 4 Changes of body weight between normal and tumor-bearing mice at different time points

3 讨论

神经母细胞瘤是儿童多发的恶性肿瘤之一。已经有研究［1，3，8］利用 4－6 周龄的BALB/c 小鼠成功建立了神经母细胞瘤模型，并开展了相关研究。其中在潜伏期方面，我们与陈嘉波等的报道比较接近。在接种成功率方面，我们与郝希伟等［9］的报道较为相近，而与李霞等［6］和徐惠绵等［7］利用 BALB/c 小鼠建立黑色素瘤、结肠癌、胃癌移植瘤模型90%以上的成功率相差较大。由此我们认为，移植瘤成功率和潜伏期与移植物的种类和活力、接种部位及受试动物的免疫状态有很大关系。

甄林林等［10］和范萍等［11］在制备人乳腺瘤移植模型时，分别选用了BALB/c裸鼠和正常的BALB/c小鼠，并且都成功的建立了移植瘤模型。但在对实验动物选择方面，很多研究［12－16］认为，裸鼠缺乏免疫排斥反应，移植后肿瘤生长良好，能保持肿瘤细胞的原有形态及细胞动力学和生物学特性，是肿瘤模型研究中较为理想、也较为常用的实验动物。范萍等［11］则认为一个理想的移植瘤动物模型所选实验动物应为免疫功能正常、成瘤后动物有一定成活期的近交系。国内外的一些研究［6，17，18］也认为，选用BALB/c小鼠而非裸鼠的原因是BALB/c小鼠的抵抗力强，存活率高，对饲养条件要求较低;其次在研究转移性疾病时，宿主的免疫反应是协调因素，可以改变对转移性疾病及化疗药物的生物反应，而裸鼠T细胞免疫功能接近于零，丧失了免疫排斥能力;并且作为实验动物，其成本高，推广价值较低。对此，我们比较认同范萍等的观点，并利用具有完全免疫功能的BALB/c小鼠建立了神经母细胞瘤模型。

在利用BALB/c小鼠建立移植瘤模型的报道中，大多采用4－6周的雌性 BALB/c小鼠［1，19］。我们认为选择单一性别、固定的年龄段是不妥的，在建立一种移植瘤模型时，应从该疾病的常见发病年龄和性别组成考虑，选择具有应用推广价值的接种年龄和性别，这样建立的模型才会比较全面真实地反映疾病发病的真实状态，利于更有效地开展相关研究。

在肿瘤移植模型制备中，常用瘤细胞和瘤组织进行接种。接种液通常包括细胞生长培养液［1］、PBS缓冲液［8］和生理盐水［19］。其中细胞接种液多用完全培养液、PBS缓冲液，而组织接种液则用生理盐水和完全培养液。由此可见尚无统一标准，也未见有关效果比较的报道。我们认为细胞在体外培养时，对环境条件的要求是比较严格的，离开培养液，细胞的生长就会停止甚至死亡。为了最大程度地减少接种液和环境的改变对细胞的影响，并保持细胞活力，我们选用培养液来制备接种液，并取得了不错的效果。

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