巴马地区壮族人群口腔黏膜细胞端粒的长度

罗晓秋 吴华裕 刘承武 彭均华 罗 桓 尹瑞兴 吕泽平 潘尚领

(广西医科大学病理生理学教研室，广西 南宁 530021)

端粒是真核细胞染色体末端的“帽状”非编码结构，由不同拷贝数的DNA重复序列和一些特殊的核蛋白组成。不同物种端粒长度(TL)差异较大，一般从50 bp到50 kb。即使是同一物种，不同个体之间或同一个体的不同组织之间，其端粒长短亦不相同。人类体细胞的端粒重复序列是(TTAGGG)n，其长度约5～15 kb，其中，人精子端粒长约15 kb，外周血白细胞端粒长约10 kb〔1〕。端粒的主要功能是维持染色体的稳定性和完整性。然而，随着细胞分裂、传代次数的增加，TL的缩短不可避免地超过某个域值，最终失去对染色体的保护作用而引发细胞衰老、凋亡或细胞的永生化及肿瘤发生〔1〕。TL也作为一个可量化的性状，被认为是细胞复制性衰老的计时器〔2〕，并逐渐被当作一些疾病或表型的生物学标记〔3，4〕。本研究通过应用荧光定量PCR的方法对世界第五长寿之乡——广西巴马地区的壮族长寿老人、其第一代子女及该地区与长寿老人无血缘关系且年龄、性别与第一代子女相匹配的健康壮族普通人进行口腔黏膜脱落上皮细胞的相对端粒长度(RTL)的测定，探讨TL随年龄变化的规律、遗传趋势及其与长寿的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 长寿组367名，男106名，女261名，年龄90～104(93.23±2.96)岁。另设两个对照组：子女组：长寿老人的第一代子女445名，男319名，女126名，年龄39～76(58.12±7.08)岁;对照组：与子女组年龄、性别相匹配且与长寿老人无血缘关系的本地普通壮族人群175名，男128名，女47名，年龄38～79(58.77±10.14)岁，见表1。长寿老人为调查时居住在广西巴马地区(东兰、巴马、凤山及都安四县)年龄≥90岁的老人，对照组为家中三代内无≥90岁老人且与长寿老人无任何血缘关系的普通人群。所有研究对象均为壮族，生活习惯及劳动条件基本相同。所有受检者在采样之前接受问诊、认知、自理能力测试，排除心、脑血管病、糖尿病、老年痴呆症等老年相关性疾病，基本上属于健康受试对象。

表1 三组不同年龄段组成(n)

1.2 标本的采集与处理 每个受试对象在采样前常规漱口，继之漱以生理盐水，然后用棉拭子刮取口腔左侧颊部黏膜30次，用装有1 ml生理盐水的离心管存放刮取物，冻存备用。

1.3 研究方法

1.3.1 基因组DNA的提取 将冻存的口腔脱落上皮细胞用蛋白酶K进行消化，过夜后用经典苯/氯仿法提取DNA，-20℃保存。

1.3.2 端粒长度测定 参照文献〔5〕，使用实时荧光定量PCR方法进行口腔脱落上皮细胞相对端粒长度的测定，主要步骤如下：①引物序列：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。端粒的引物：上游：5'ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT 3'，下游：5'TGTTAGGTATCCCTATCCCT ATCCCTATCCCTATCCCTAACA 3';内参36B4基因的引物：上游：5'CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC 3'，下游：5'CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA 3';②端粒与内参36B4基因Ct值的测定：端粒与内参36B4基因的扩增在不同的96孔板中进行，每个96孔板均含一个相同的参照样品。反应体系均为20 μl，其中Mix(Roche产品)均为10 μl，DNA模板均为50 ng，端粒上下游引物终浓度均为0.8 μmol/L，36B4基因上下游引物终浓度均为0.4 μmol/L，其余体积用双蒸水补足。端粒的反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，49℃ 1 min，进行 2 个循环，然后，95℃ 15 s，62℃ 1 min，72℃ 20 s，进行40 个循环并在 72℃收集荧光。36B4基因的反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃1 min，40个循环，60℃收集荧光，反应结束绘制熔解曲线。

1.3.3 T/S比率的计算 采用real-time PCR仪配套软件，分别确定端粒反应及内参36B4基因反应的 Ct值-Ct及 Ct(36B4)，根据PCR反应产物以2的指数倍递增原理，T/S比率接近于公式〔2Ct(telomeres)/2Ct(36B4)〕-1=2-△Ct。为消取每个96孔板间的误差而选用参照样品作为阳性对照，RTL即为相对T/S值=2-△Ct(待测样品)/2-△Ct(参照样品)。

1.4 统计学处理 用统计软件SPSS13.0进行分析，各组之间RTL的中位数差异用两个独立样本的Wilcoxon秩和检验;RTL与年龄的关系用Spearson相关、偏相关进行统计分析。

2 结果

2.1 TL的遗传 将对照组与长寿组组合成年龄从38～104岁且个体间无血缘关系的普通群体，其RTL与年龄的相关系数为(R=-0.102，P=0.018);将子女组与长寿组组合成年龄从39～104岁有血缘关系的长寿群体，其RTL与年龄的相关系数为(R=-0.026，P=0.461)，表明TL的维持在长寿群体中更优越。子女组与对照组在较低年龄段(＜65岁年龄段)RTL虽无显著差异，但子女组中较高年龄段(65岁～年龄段)的RTL明显长于同年龄段的对照组(P=0.026)，同时，长寿组(90岁～年龄段)的RTL与对照组高年龄段(65～年龄段)的RTL相当(1.662～1.709，P=0.755)，提示长寿群体中特别到了65岁以后端粒的缩短速率明显减慢。见表2。

表2 长寿组、子女组、对照组不同年龄段的RTL〔中位值(范围)〕

2.2 TL与年龄 以年龄为横坐标，口腔上皮脱落细胞 RTL为纵坐标，绘制散点图。因不同组别及性别间端粒长度存在差异，所以以组别和性别为控制变量，应用偏相关分析。总体的RTL与年龄的相关系数为(R=-0.109，P=0.001);控制组别后，总体男性的RTL与年龄的相关系数为(R=-0.121，P=0.005)，女性为(R=-0.091，P=0.059)。这些结果表明，在研究人群中，口腔黏膜细胞RTL随着年龄的增大而缩短，这种变化在男性中也存在但在女性中没有显示出来。

2.3 TL与性别 总体人群、组合人群及不同组别各年龄段男、女之间的RTL比较见表3。在长寿组与子女组组合的长寿群体、子女组中，各年龄段男性和女性的 TL均无显著差别(P＞0.05);对照组的较高年龄段(65～年龄段)显示男性RTL明显长于女性(P=0.006)，同时总体人群、长寿组与对照组组合的普通人群在该年龄段也显示男性RTL明显长于女性RTL(P总体=0.024，P组合=0.006)，但这均由对照组的性别差异 形成的。

表3 各组别不同年龄段不同性别的RTL〔中位值(范围)〕

3 讨论

口腔黏膜脱落上皮细胞是在体细胞，它的采集方法简单且相对无侵袭性，特别适用于参与者较多且年龄较大的特殊群体，其衰老在一定程度上可反映机体的衰老过程，因此已被用于人类衰老/长寿的研究。口腔黏膜脱落上皮细胞DNA端粒长度与年龄〔6〕及年龄相关性疾病〔7，8〕的研究目前在国外已有不少报道。端粒是染色体末端的保护结构，它的长度与人类(包括长寿老人)的生命寿限是密切相关的〔9〕，但由于缺乏有效的对照组使许多研究的结果不一致。与Atzmon等〔9〕的研究类似，我们将受试对象分为长寿组、子女组、对照组，其中子女组为长寿老人的第一代子女，对照组为年龄、性别与子女组相匹配且与长寿老人无血缘关系的同一地区具有相同生活背景的普通人群。这种有长寿趋势的子女组及与子女组相匹配的对照组的选取为长寿表型的研究提供了有效的遗传学对照。

本研究说明长寿群体的个体在进入一定年龄后(本研究为65岁)TL缩短速率变慢，表明长寿群体对TL的维持可能存在特殊的机制，与Atzmon等〔9〕的研究类似。本研究中子女组在较高年龄段(65岁～年龄段)的RTL明显长于同年龄段的对照组，而较低年龄段(＜65岁)RTL在子女组与对照组之间无差别，同时，长寿组(90岁～年龄段)的RTL与对照组高年龄段(65岁～年龄段)的RTL相当，进一步说明TL的遗传性。这可能是生存差异所致高寿者拥有较长的端粒的原因，即各种年龄相关性疾病使端粒较短者死亡而被淘汰出自然人群，因逃避了此类疾病及其所致的端粒缩短而获得高寿的个体，其端粒较长，再遗传给子代，使子代也保持了较长的端粒。

Hayflick假说是指细胞分裂能力的有限性，体细胞端粒长度在DNA复制过程中的缩短支持了该假说，端粒的缩短已经被认为是一种生物钟〔10，11〕。尽管其缩短速率有不同的报道〔10〕，但均随着年龄的增长而缩短。本研究中，总体人群RTL与年龄呈显著负相关，即年龄越大，端粒长度越短，与其他学者的结果一致〔12～14〕，再次表明TL与衰老之间的密切关系，或换言之，TL可以当作衰老的生物学标记之一。

本研究的流行病学调查显示长寿女性(71.1%)的数量远超于男性，这与 Tabatabaie 等〔15〕、Boyden 等〔16〕进行的长寿群体研究是一致的，表明女性个体在长寿表型中有一定优势。M¨oller等〔10〕和Njajou等〔17〕报道女性的端粒长于男性，但本研究中长寿组、子女组的女性RTL并不长于男性，虽然流行病学调查显示，长寿者中女性远多于男性，但长寿男性和女性之间的TL并无明显区别，表明除TL的变化对衰老的影响外，高寿的获得可能源自其他因素。对照组的高年龄段(65～年龄段)出现了男性RTL比女性长(P=0.006)，这可能是由于进入更年期之后女性体内的雌激素水平下降，与日本学者Guan等〔18〕的发现类似。但子女组并没有出现该现象，可能说明有长寿趋势的个体体内存在某种对抗雌激素下降的机制而维持女性在65岁年龄之后仍保持较高端粒水平，此问题值得进一步探究。

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