长治地区腹泻患者致泻性大肠杆菌的检测与分析

庞 慧，赵爱兰，白向宁，王立兵，郭步平，熊衍文

2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室；

3.山西省长治医学院附属和平医院检验科

致泻性大肠杆菌是引起人类腹泻的重要病原菌，也是发展中国家面临的主要公共卫生问题[1]，我国部分地区的调查显示，致泻性大肠杆菌仍然是引起腹泻的主要病原菌。随着分子生物学和检测技术的发展，利用PCR方法检测和鉴别得到广泛运用[2－3]。本研究以致泻性大肠杆菌的7个毒力基因eaeA、aggR、ipaH、stx1、stx2、lt、stIb及 16SrRNA基因rrs作为内对照的8重PCR检测方法，对山西省长治地区的腹泻患者粪便标本进行分离、鉴定及菌株特征分析。

1 材料与方法

1.1 标本 收集2011年10月－2012年10月就诊于长治医学院附属和平医院和长治市人民医院的腹泻患者，共170份。采集时粪便标本与等量30%甘油LB肉汤混匀后，立即置－20。C冰箱保存，冷冻运送。阳性对照标准菌株分别为Ec042（EAEC）、EDL933（EHEC）、44825（EIEC）、E2348／69（EPEC）和10407（ETEC），均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所新病原室保存。

1.2 主要试剂与仪器 LB培养基、脑心浸液培养基、EC增菌肉汤为北京陆桥技术有限责任公司产品；ECC大肠杆菌显色培养基为CHROMagar产品；DNA聚合酶和DL2000 DNA Marker为宝生物工程（大连）有限公司的产品；2×Taq MasterMix为北京康为世纪生物科技有限公司产品；PCR仪（SensoQuest Labcycler）为德国Senso公司；凝胶成像系统（Gel Doc2000）为美国Bio－Rad公司；PCR引物合成和测序由生物工程（上海）有限公司完成。

1.3 粪便标本预增菌30%甘油LB肉汤中冻存的粪便标本解冻后，取200μL接种于3mL的EC肉汤中，37。C震荡培养18～24h。本研究的实验部分均在中国疾病预防控制中心传染病预防控制所新病原室完成。

1.4 DNA模版制备 取上述增菌液1.5mL于无菌EP管中，13 000r／min离心10min，弃上清，沉淀中加入180μL快速裂 解 液 （成 分 包 括：4mM NaCl，1mM Tris－Cl，2μ 及EDTA，0.04%Triton X－100，均为sigma公司产品），混匀后置100。C沸水中煮10min，13 000r／min离心10min，上清即为DNA模板。

1.5 致泻性大肠杆菌筛查 参照文献[4]报道的8个基因的引物组成及PCR反应条件，对增菌液制备的DNA模板进行多重PCR检测。

1.6 致泻性大肠杆菌的分离培养和鉴定 对于多重PCR检测阳性的增菌液，将其接种ECC大肠杆菌显色培养基，37。C培养过夜，从ECC培养基上挑取蓝色或无色疑似大肠杆菌形态特点的菌落10个，继续用多重PCR对疑似菌落进行检测；将阳性的菌落接种普通LB培养基上，37。C培养过夜，用单重PCR对LB平板上的菌落进一步确认后，采用API 20E生化条对其进行系统生化鉴定。

1.7 典型EPEC与非典型EPEC的鉴别 对于eaeA阳性的菌株，进一步采用PCR扩增bfpA基因，以区分典型EPEC与非典型EPEC。bfpA基因检测的PCR引物及扩增条件参见文献[3]。

1.8 O血清群鉴定 利用丹麦血清学研究所生产的大肠杆菌全套O抗血清，参照说明书对分离的致泻性大肠杆菌进行O血清群测定。

2 结 果

2.1 致泻性大肠杆菌的分离 从170份腹泻粪便标本中筛查到致泻性大肠杆菌毒力基因阳性标本25份，这25份标本中分离出致泻性大肠杆菌20株，其中eaeA基因阳性12份，分离菌株11株；aggR基因阳性10份，分离菌株7株；lt／st基因阳性3份，分离菌株2株。有1份标本中同时分离到EPEC和EAEC。致泻性大肠杆菌分离株的毒力基因检测结果见图1。

图1 不同致泻性大肠杆菌分离株多重PCR检测结果M：DL2000DNA Marker，泳道1～11为eaeA基因阳性菌株，泳道12～18为aggR基因阳性菌株，泳道19～20为stIb＋lt基因阳性菌株，泳道21～22为阳性对照，泳道23为空白对照。Fig.1 Multiple PCR results of diarrheagenic Escherichia coli isolates M：DL2000DNA Marker；1－11：Bacteria with eaeAgene；12－18：Bacteria with aggRgene；19－20：Bacteria with stIb or lt gene；21－22：Positive control；23：Blank.

2.2 5类致泻性大肠杆菌的分离 20株致泻性大肠杆菌中，11株eaeA基因阳性，判定为EPEC；7株aggR基因阳性，判定为EAEC；另有2株lt与stIb基因均为阳性，判定为ETEC。性别分布上，男性中分离出11株（11／94），女性9株（9／76）；从季节分布上分析，腹泻主要集中在5－8月份，共分离出18株菌。从表1的结果看，致泻性大肠杆菌在5岁以下儿童中的分离率为最高。5类致泻性大肠杆菌中，以EPEC为主，其次是EAEC。本研究中的170份腹泻患者粪便标本中未分离到EIEC及EHEC。

2.3 EPEC分离株特征11株EPEC分别属于O86、O91、O126、O128abc、O138、O157、O168血清群，4株未能分型。用检测bfpA基因的方法来区分典型EPEC与非典型EPEC，结果11株bfpA基因均为阴性，为非典型EPEC。

表1 不同年龄段致泻性大肠杆菌的分离率[%（阳性数／检查数）]Tab.1 Isolation rates of the diarrheagenic Escherichia coli in different groups

2.4 EAEC分离株特征 7株EAEC分别属于O3、O83、O68血清群，4株未能分型。

2.5 ETEC分离株特征 2株ETEC中，同时产耐热肠毒素与不耐热肠毒素（lt与stIb基因均为阳性），血清群分别为O6和O168。

3 讨 论

本文比多重PCR对粪便标本增菌液初筛后，结合细菌分离对山西省长治地区腹泻患者粪便标本中的致泻性大肠杆菌进行分析，发现这一地区致泻性大肠杆菌的分离率为12%，其中男性分离率为7%，女性为5%；5岁以下儿童的分离率最高，为7%，但低于许多国家报道的水平[5－7]。这可能与调查时间短、地区局限有关；也可能是由于长治地区患者在就诊前服用抗生素导致细菌分离降低有关。阳性者主要集中在夏秋季，正是瓜果蔬菜盛行之时。原始粪便标本初筛后阳性PCR共25份，但经分离培养后获取致泻性大肠杆菌菌株的阳性PCR为20株。因为PCR的灵敏度较高[4]，而粪便标本中的目标菌量、细菌存活状态以及背景菌群均可影响到分离的成功率。对于大肠杆菌的分离，通常采用增菌后接种选择性培养基，挑取几个可疑菌落，进行大肠杆菌的生化鉴定、血清群鉴定，条件许可的实验室进行相关毒力基因检测，判断是否属于致泻性大肠杆菌以及属于哪一种类型的致泻性大肠杆菌。实践发现，利用多重PCR初筛的方法，可对致泻性大肠杆菌感染情况做出快速判断，且可降低工作量。

长治地区分离的致泻性大肠杆菌中，以EPEC为主，其次是EAEC[5，8]。EPEC主要引起的是水样腹泻，且多见于2岁以下儿童，本调查显示EAEC在致泻性大肠杆菌中占有很高的比例。

分析本研究中对分离的致泻性大肠杆菌O血清群，发现EPEC中出现新的血清群O91、O138、O157，EAEC中出现 O3、O83、O68，国内其它地区的研究也发现感染性腹泻的病原菌血清群发生了变迁的报道。因此单纯依靠血清群对致泻性大肠杆菌做出判断会出现漏诊，在有条件的实验室，对于致泻性大肠杆菌的检测及判断应结合毒力基因检测的分子生物学方法。

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