纳他霉素对青皮核桃保鲜的影响*

郭园园，鲁晓翔，李江阔，梁冰，郭兴月，陈绍慧，张鹏

1(天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津，300134)

2(国家农产品保鲜工程技术研究中心，天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津，300384)

3(沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳，110866)

核桃(Juglans regiaL.)又称胡桃、羌桃。核桃种仁富含蛋白质、磷脂、维生素、矿物质及人体必需的不饱和脂肪酸等营养物质，具有滋养脑细胞，增强脑功能，防止动脉硬化，降低胆固醇等作用［1］。近年来，鲜食核桃因其营养丰富、口感良好、相对较低的脂肪含量等，在国内外越来越受到人们的喜爱［2］。但青皮核桃采后呼吸旺盛，贮藏时极易腐烂，影响其市场供应期［3］。因此，青皮核桃的保鲜技术亟待解决。

目前，利用保鲜剂保鲜青皮核桃的研究尚未见报道。纳他霉素是一种天然保鲜剂，安全性高，且具有广谱高效的抗真菌作用［4］。据报道［5－6］，纳他霉素在低浓度下就能有效抑制真菌生长，对几乎所有的真菌类都有很强的抑制性，已在香菇、乳制品、肉制品、果汁饮料、葡萄酒保藏上得到应用，效果较好。本实验利用纳他霉素对青皮核桃进行处理，研究其对青皮核桃品质变化的影响，以探讨青皮核桃的贮藏保鲜提供新的技术。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料:2012年9月2日采自北京平谷县核桃实验园基地，选取大小均匀、无机械损伤、无病虫害的青皮核桃供实验用。

主要试剂:纳他霉素，北京东方瑞德生物技术公司;三氯乙酸(分析纯)，天津市江天化工技术有限公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(均为分析纯)，天津市科威有限公司;邻苯二酚(为分析纯)，天津市光复精细化工研究所;PVP、DTT(均为分析纯)，天津博美科生物技术有限公司;亚油酸钠、Tri tonX-100(生化试剂)，天津博美科生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

冷库:国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津)(以下简称保鲜中心)，库内温度 －0.5～0.5℃;CW-700d分光测色计，柯尼卡美能达(中国)投资有限公司;TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;SIGMA 3－30K高速离心机，德国SIGMA实验室离心机公司;微孔保鲜袋(厚度0.02 mm)由保鲜中心提供。

1.3 实验材料预处理

(1)对照组(CK):将选取的青皮核桃于冷库［(0±0.5)℃］中进行预冷处理，充分预冷24 h后，用微孔袋(厚度0.02 mm)包装后放入纸箱，继续冷藏。

(2)处理组1(SY1):将选取的青皮核桃在质量分数为600 mg∕L的纳他霉素中浸泡3 min，沥干后于冷库［(0±0.5)℃］中预冷24h后，用微孔袋(厚度0.02 mm)包装后放入纸箱，继续冷藏。

(3)处理组2(SY2):将选取的青皮核桃在质量分数为800 mg∕L的纳他霉素中浸泡3 min，余下步骤同SY1处。

(4)处理组3(SY3):将选取的青皮核桃在质量分数为1 000 mg∕L的纳他霉素中浸泡3 min，余下步骤同SY1处。

上述各处理组按10 kg/箱包装，且每隔15d测定一次各项指标，每个处理各进行3次重复测定。

1.4 测定指标和方法

1.4.1 霉腐率

霉腐率/%=(霉烂果个数/处理的总果数)×100

1.4.2 色差的测定

随机取5个青皮核桃用CW－700 d分光测色计测定。测定时在果实对称的位置用记号笔标记，每隔15 d对标记点进行测定，并取平均值。a*为负值，表示绿色。

1.4.3 丙二醛(MDA)含量测定

采用硫代巴比妥酸比色法［7］。

1.4.4 多酚氧化酶(PPO)

采用儿茶酚比色法［8］。

称取核桃仁冻样3 g于预冷的研钵中，加入适量0.05 mol/L pH 7.8磷酸缓冲液(总用量20 mL)，冰浴研磨成匀浆，于4℃下15 000 r/min离心10 min，再取上清液于4℃下10 000 r/min离心10 min。取3 mL上清酶液，然后加入3.9 mL pH 7.8磷酸缓冲液，1.0 mL 0.1 mol/L儿茶酚，于37℃水浴保温10 min，迅速放入冰浴中，立即加入2mL体积分数20﹪三氯乙酸终止反应，于420 nm处测其吸光度值，以磷酸缓冲液代替酶液为对照调零。

1.4.5 过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法［9］

称取核桃仁冻样0.2 g于预冷的研钵中，加入20 mL预冷后的pH 7.5、0.05 mol/L的磷酸缓冲液(内含0.005 mol/L二硫苏糖醇和2%PVP)，在冰浴中研磨成匀浆，于4℃下15 000 r/min离心 20 min，取0.05 mL粗酶液，加入3 mL 0.02 mol/L H2O2后，在240 nm处测定2 min内样品的吸光度变化。

1.4.6 脂氧合酶(LOX)参考陈昆松［10］的方法测定

称取核桃仁冻样1.0 g，冰浴研磨，加入0.05mol/L磷酸缓冲液(pH值7.0)，并使最终体积为20 mL，于4℃下15 000 r/min离心30 min，上清液为LOX的提取液。加入亚油酸钠25 μL，pH 7.0磷酸缓冲液2.775mL，30℃温育，加 200 μL 酶液后 20 s开始计时，记录234 nm处测定1 min内吸光度，重复3次。

以上酶活性计算公式均为:

式中:X为酶的比活力(0.01ΔA/［g(FW)min］;△A为反应时间内吸光度的变化;D为稀释倍数即提取的总酶液为反应系统内酶液体积的倍数;t为反应时间/min;m为称取果肉质量/g。

1.4.7 数据处理

所有数据采用 Excel 2003软件处理，并采用SPSS16.0软件的新复极差法(Duncan)进行方差分析(P=0.05)和多重比较。

2 结果与分析

2.1 纳他霉素对青皮核桃霉腐率的影响

图1表明，各组核桃的霉腐率随贮藏期的延长而增加。CK到贮藏60 d后霉腐率迅速增加，而各处理组在75d时霉腐率才大幅增加，而此时CK的霉腐率已达到48.18%，果实严重腐烂、发霉，已失去商品价值;而处理组在贮藏75d时的霉腐率依 SY1、SY2、SY3分别为23.69%、9.75%、6.73%。在整个贮藏期，霉腐率大小顺序为CK＞SY1＞SY2＞SY3。从贮藏第15天开始，CK的青皮核桃霉腐率显著(P＜0.05)高于处理组;SY3的霉腐率略低于SY2，但极显著(P＜0.01)低于SY1。由此可知，纳他霉素处理组有效地抑制了青皮核桃的霉变及腐烂，能更好地保持青皮核桃的品质，其中以SY3的防霉效果最好。

图1 纳他霉素对青皮核桃霉腐率的影响Fig.1 Effect of natamycin on decay rate of green juglans

2.2 纳他霉素对青皮核桃色差的影响

青皮核桃果皮色泽是评价其外观品质的重要指标。通常，青皮核桃的果皮在贮藏开始时为绿色，随着贮藏时间的延长，果皮逐渐变黄，最后变为黑褐色。本试验以色差计对青皮核桃的果皮色泽变化进行跟踪监测，其中a*正值表示偏红，负值表示偏绿。a*值越小则表明颜色越绿。实验结果如图2所示。

由图2可见，各组a*随着贮藏时间的延长均呈上升趋势，但各组青皮核桃的a*在贮藏前期差异并不明显。至贮藏30 d，各组a*开始迅速增大。在贮藏60 d时，CK组的a*值达到4.39，极显著(P＜0.01)高于处理组，但各处理组间无显著差异。至贮藏后期，各组青皮核桃的a*变化趋于缓慢。在整个贮藏过程中，各组a*的大小顺序为CK＞SY1＞SY2＞SY3。可知，纳他霉素处理组能够有效抑制a*值的增加，较好保持青皮核桃的色泽，其中以SY3的保色效果最好。

图2 纳他霉素对青皮核桃a*的影响Fig.2 Effect of natamycin on a*of green juglans

2.3 纳他霉素对青皮核桃MDA的影响

丙二醛(MDA)是膜脂过氧化作用的主要产物之一，其含量的增加是膜脂过氧化加强，膜受伤而加剧衰老的表现，它反映了果实在逆境下受伤害的程度［11］。

图3 纳他霉素对青皮核桃MDA含量的影响Fig.3 Effect of natamycin on MDA content of green juglans

图3显示，各组的MDA含量的变化均为先增后降的趋势，且有双峰曲线。各组在贮藏15d时均出现第 1 个高峰，CK、SY1、SY2、SY3 的峰值分别为5.39%、5.18%、4.47%、4.06%，可能是因为青皮核桃对低温的应对反应所致;之后由于青皮核桃适应了贮藏温度，而使MDA含量逐渐降低。贮藏60d时出现第2个高峰，则可能是因为贮藏后期青皮核桃衰老的原因所致。在贮藏75d时，CK的MDA含量略高于SY1和SY2，SY3的MDA含量极显著(P＜0.01)低于其他各组。可见，处理组能够降低MDA含量，其中，SY3延缓青皮核桃衰老的效果最好。

2.4 纳他霉素对青皮核桃多酚氧化酶(PPO)活性的影响

PPO含量增加能够氧化酚类物质造成酶促褐变，从而降低酚类物质的抗氧化能力［12］。

图4 纳他霉素对青皮核桃PPO比活力的影响Fig.4 Effect of natamycin on PPO activity of green juglans

由图4可见，CK的PPO比活力出现先降后升的趋势，处理组则呈波浪式变化。贮藏初期各组青皮核桃的PPO比活力均下降，可能是低温环境降低果实的代谢速率，抑制褐变发生。在贮藏30d，各处理组均出现了峰值，CK的PPO活性略高于处理组，而CK则未出现PPO活性高峰，可能是由于纳他霉素加强了核桃仁应对环境的能力，因而之后的PPO比活力略有下降。在贮藏75d时，CK的PPO比活力迅速增大，各处理组也再次均出现峰值，可能是青皮核桃的品质急剧下降，衰老加速所致，此时CK的PPO比活力为12.067 0.01ΔA/［g(FW)·min］，极显著(P＜0.01)高于 SY1(11.05 0.01ΔA/［g(FW)·min］、SY2(10.46 0.01ΔA/［g(FW)· min］、SY3(10.22 0.01ΔA/［g(FW)·min］。在整个贮藏期中，CK 的PPO比活力均高于处理组，SY3的PPO比活力均低于SY1、SY2。可见，SY3处理能够有效地降低核桃PPO比活力，延缓其衰老。

2.5 纳他霉素对青皮核桃过氧化氢酶(CAT)活性的影响

CAT能减少果实内的H2O2积累，从而延缓果实衰老。图5结果显示，各组的CAT活性均呈先增后降的趋势，CK呈单峰曲线，在贮藏45d出现CAT活性高峰(7410.98{0.01ΔA/［g(FW)·min］};而处理组呈双峰趋势，在贮藏15d和45d均有高峰，由此看出，纳他霉素处理诱导了CAT活性高峰的出现。在贮藏15d，CK的CAT酶活性仅为4 963.79{0.01ΔA/［g(FW)·min］}，极显著(P＜0.01)低于各处理组的 CAT 活 性 (6323.53、7187.23、7829.36{0.01ΔA/［g(FW)·min］}。在贮藏45 d 时，SY3 的CAT 酶活性(9 215.61{0.01ΔA/［g(FW)·min］}显著(P＜0.05)高于其它组，但其他组之间并无明显差异。在整个贮藏期，CK的CAT比活力低于处理组，SY3的CAT的酶活性均高于SY1、SY2。结果表明，纳他霉素处理组能有效地提高CAT比活力，其中以SY3的效果最佳。

图5 纳他霉素对青皮核桃CAT比活力的影响Fig.5 Effect of natamycin on CAT activity of green juglans

2.6 纳他霉素对青皮核桃脂氧合酶(LOX)活性的影响

LOX以细胞膜释放的游离脂肪酸为底物，催化形成氢过氧化物、自由基和茉莉酸(JA)等促进衰老的物质，故其直接或间接地参与组织的衰老进程［13］。

图6 纳他霉素对青皮核桃LOX比活力的影响Fig.6 Effect of natamycin on LOX activity of green juglans

如图6所示，各组的LOX的比活力的变化趋势均为先增后降再增的双峰曲线。在贮藏15d时出现第一个峰值，此时 CK的峰值(54.51{0.01ΔA/［g(FW)·min］}略高于各处理组的峰值。在贮藏60d时，各组均出现第二个高峰，此时CK的LOX比活力(64.48{0.01ΔA/［g(FW)· min］}均高于 SY1(54.48{0.01ΔA/［g(FW)· min］}、SY2(54.53{0.01ΔA/［g(FW)·min］}、SY3(44.53{0.01ΔA/［g(FW)·min］}。这可能是由于青皮核桃的品质急剧下降，衰老加速所致。在整个贮藏期中，CK的LOX活力高于各处理组的LOX活力，而SY3的LOX比活力低于SY1与SY2。说明SY3处理能有效降低LOX活性，延缓衰老。

3 讨论

3.1 纳他霉素对青皮核桃品质的影响

纳他霉素是目前国内外唯一的抗真菌防腐剂，是一种天然、广谱、高效安全的酵母菌及霉菌等丝状真菌抑制剂，它不仅能够抑制真菌，还能防止真菌毒素的产生。有关纳他霉素在青皮核桃的应用目前尚未见报道。Zhou［14］研究发现，对红地球葡萄进行纳他霉素处理，可有效地降低呼吸强度、失重率、腐烂率和落粒率。周翠英［15］研究发现，纳他霉素处理可有效控制草莓果实表面霉菌数量，减慢叶柄叶绿素含量下降的速率，抑制果实有机酸与糖分的下降，较好地维持果实的营养，延长贮藏期。本文实验表明，纳他霉素可以降低青皮核桃的霉腐率与a*值的升高，能够延缓MDA含量的增加，其中以1 000 mg/L纳他霉素处理效果最好。

3.2 纳他霉素处理对青皮核桃PPO、CAT和LOX活性的调控

CAT属于抗氧化酶，能及时清除活性氧，保持膜结构完整，与果实的成熟及衰老有关。有研究表明，当植物受到病原菌侵害时，CAT的活性升高，抗氧化性加强、木质素合成、次生代谢加快，以抵抗病原菌的侵染［16］，CAT在木质素生物合成的最后一步反应过程中催化H2O2分解而发挥作用［17］，有效延缓了果实衰老。本实验纳他霉素处理促进了CAT活性，从而提升了青皮核桃对病原菌的抵抗能力。

PPO是存在于植物体内与抵抗病原微生物浸染有关的酶［18］。PPO在酶促褐变中起重要作用，PPO含量增加能够氧化酚类物质造成酶促褐变，降低酚类物质的抗氧化能力。本实验中的纳他霉素处理抑制了青皮核桃的PPO活性，从而延缓其衰老。

LOX与果实的成熟衰老密切相关，LOX启动膜脂过氧化作用，使膜磷脂不断水解，产生游离脂肪酸。研究表明，LOX在植物的生长、发育、成熟衰老以及机械伤害、病虫侵染等过程起调节作用［19］。本实验纳他霉素处理抑制了核桃LOX活性，这可能是纳他霉素的抗菌性抑制了核桃LOX的活性。

本实验结果表明，纳他霉素处理能够有效控制青皮核桃霉腐率的增加，较好的保持青皮核桃的原有色泽，延缓MDA含量的增加，提高CAT活性，降低PPO和LOX活性。其中，以1 000 mg/L纳他霉素处理的青皮核桃的保鲜效果最佳。

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